תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להגביר את ייצור כמירה ללא השימוש של ציוד חדש. שינוי כיוון פשוטה של העובר להזרקה ניתן להגדיל את מספר העוברים המיוצר, להפחית באופן פוטנציאלי את ציר הזמן germline שידור.
Abstract
במאמץ להגדיל את יעילות ביצירת עכברים מהונדסים באמצעות מתודולוגיות ES תא, אנו מציגים עיבוד בפרוטוקול הנוכחי של הזרקת הבלסטוציסט. כאן אנחנו מדווחים כי סיבוב פשוט של העובר, וכן הזרקה דרך טראנס-הפנימית תא בנפח גדול (TICM) גדל אחוז עכברים chimeric מ 31% ל- 50%, עם אין ציוד נוסף או יותר התמחה הדרכה. 26 שונים מוכלאים שיבוטים, שיבוטים הכולל 35 הוזרקו על פני תקופה של 9 חודשים. היה הבדל משמעותי ההריונות או קצב ההחלמה של העוברים בין טכניקות מסורתיות הזרקת TICM. לכן, ללא שינוי כלשהו העיקריים בתהליך הזרקה, מיצוב פשוטה של הבלסטוציסט ואת הזרקת דרך ICM, משחררים את התאים ES לתוך חלל blastocoel יכולים פוטנציאל לשפר את הכמות של ייצור chimeric ובעקבות germline שידור.
Introduction
במשך קרוב ל-25 שנים, הקמת יישוב גנטית עכברים כבר תהליך איטי, לעיתים קרובות הקשו על ידי צוואר בקבוק בשלב microinjection תא blastocysts ES לדור של germline משדר כימרות. הפיתוחים האחרונים, כולל1,CRISPR/Cas92 פילוח תאים ES, תפוקה גבוהה ES תא דור מהמגזר כמו komp ב, השתפרו הדור/הזמינות של תאים ES מהונדסים. עם זאת, הדור של germline כימרות נשאר צוואר בקבוק ביצירת עכברים מהונדסים אלה ES תאים3,4. תפוקה גבוהה ES תא דור פרויקטים שייסרו על ידי השתנות גבוהה באיכות תא ES, אשר הוא קריטי עבור יצירה מוצלחת של germline כימרות. בנוסף, חלק מהשורות תא ES שימוש בדרך כלל ידועים הגבוהה אנאפלואידיה וייצור קשה germline כימרות המוסמכת5.
פותחו שיטות רבות ליצירת עכברים עם גם שימרה גבוה יותר, או לגמרי ES תא נגזר עכברים6,7,8,9,10. בעוד כל אחת ממערכות אלה יש את היתרונות שלה, יש להם גם החסרונות. הדור של tetraploid היו בעת יצירת תאים ES 100% נגזר עכברים, הוא לא יעיל, מוגבל בדרך כלל קווים outbred 5,6. שיטות חדשות של הזרקת morula יכול להניב כימרות אחוז גבוה, מתקרב 100%, אבל בדרך כלל דורשים ציוד נוסף משמעותי (לייזרים או piezos) ואימונים10,11. במעבדות איפה טכניקות אלה שכבר נמצאים במקום, מתודולוגיה חדשה זו ייתכן שלא יהיה צורך.
המטרה של מחקר זה היתה למצוא שיטה המשתמשת טכניקות נפוצות וציוד זמינים כדי להגביר את הקצב של כמירה הדור, ומגדילים את הסיכוי germline שידור של אלל mutant להקים את המושבה העכבר עוקבות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה זמן רב כבר חשבה כי כל הפרעה של ICM יכול להוביל התמותה, למעשה, הנוכחי הבלסטוציסט microinjection פרוטוקולים עדיין מזהירים זה12,13. מה שהראתי כאן זה microinjection דרך ICM אינה פוגעת העובר, והיא מגדילה את היבול של כימרות.
המנגנון המדויק בשביל האפקט הזה לא זוהתה. ע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך [חלקית] על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה. תודה מיוחדת Shyamal Peddada לשם ניתוח סטטיסטי. אנחנו גם רוצים להודות יאו האמפרי, גארי ציפור, יוקי םינוי לסקירה של כתב היד הזאת, פרנקו דימיו עבור המשך תמיכה וייעוץ שלו.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
