Summary
في هذا العمل، ويصف لنا بروتوكولات التحقيق في دور حويصلات خارج الخلية (EVs) صدر عن الكريات الحمراء المنجلية المصابة. على وجه الخصوص، نحن نركز على تفاعلات المركبات الكهربائية مع خلايا بطانية.
Abstract
الملاريا ومرض يهدد الحياة الناجمة عن الطفيليات المتصورة ، و المنجلية الأكثر انتشارا في القارة الأفريقية والمسؤولة عن معظم الوفيات المرتبطة بالملاريا على الصعيد العالمي. العديد من العوامل بما في ذلك عزل الطفيلي في الأنسجة، والخلل في الأوعية الدموية، والاستجابات التهابات تؤثر على تطور المرض في الأشخاص المصابين بالملاريا. المنجلية-خلايا الدم الحمراء المصابة (إيربكس) إطلاق سراح حويصلات خارج الخلية الصغيرة (EVs) التي تحتوي على أنواع مختلفة من جزيئات الشحنات التي تتوسط الاتصال المرضية والخلوية بين الطفيليات والمضيف. المركبات الكهربائية هي كفاءة تناول الخلايا التي كانت تعدل وظيفتها. هنا نناقش استراتيجيات لمعالجة دور المركبات الكهربائية في تفاعلات الطفيلي المضيف. أولاً، نحن تصف طريقة واضحة لوضع العلامات وتعقب تدخيل EV بخلايا بطانية، استخدام صبغة رابط خلية خضراء. ونحن التقرير الثاني، طريقة بسيطة لقياس النفاذية عبر أحادي الطبقة غشائي خلية باستخدام ديكستران مسمى فلوريسسينتلي. وأخيراً، نعرض كيفية التحقيق في دور جزيئات الحمض النووي الريبي غير الترميز صغيرة في وظيفة الخلايا البطانية.
Introduction
ووفقا "منظمة الصحة العالمية"، كانت هناك 212 مليون حالة جديدة من الملاريا في جميع أنحاء العالم بحلول عام 2015 وتوفي حوالي 429,000 شخصا، معظمهم من الأطفال دون سن الخامسة من العمر1. الآليات التي تؤدي إلى المرض الشديد، الذي يرتبط غالباً بالخلل في الأوعية الدموية، ما زالت غير محددة2. تفرز المتصورة-إيربكس صغيرة ثنائية-دهن غشاء المجالات المعروفة باسم حويصلات خارج الخلية (EVs). ومن المعروف أن هذه المركبات الكهربائية التي يحتمل أن تكون ذات الصلة بعملية العدوى والمضيف الاستجابة المناعية للعدوى؛ ومع ذلك، يعرف الكثير عن الدالة exact لهذه الحويصلات الصغيرة أثناء الإصابة بالملاريا3. فمن الممكن أنها تلعب دورين هامين: من ناحية، أنها قد تسهم في التسبب بتفعيل الضامة4،5؛ ومن ناحية أخرى، قد توفق الاتصالات الخلوية بين الطفيليات والطفيليات والمضيف6،7. وفي الواقع، يمكن نقل الطفيليات البروتينات أو الأحماض النووية بين بعضها البعض عن طريق المركبات الكهربائية. على سبيل المثال، المثقبيات البروسية rhodesiense المركبات الكهربائية يمكن نقل عامل فوعة Serum Resistance-Associated (SRA)، ويمكن أن تستهدف الكريات الحمراء المضيفة و البروسية ت أخرى8. وعلاوة على ذلك، المنجلية-إيربكس الاتصال بين بعضها البعض من خلال نقل الأحماض النووية داخل المركبات الكهربائية. وهذا ما يسمح الطفيليات على الوجه الأمثل، وتزامن نموه. في الواقع، قد تكون الجهة الرئيسية المنظمة للتحويل جاميتوسيتي المركبات الكهربائية، وبالتالي المساهمة في تنظيم مرحلة انتقال7.
ليس فقط القيام بتنظيم المركبات الكهربائية الطفيليات، وأنها تتوسط أيضا تفاعلات الطفيلي المضيف. اكتشفنا مؤخرا أن المركبات الكهربائية من إيربكس تحتوي على المستمدة من المضيف ميكرورناس (ميرناس؛ والأنواع الصغيرة من الحمض النووي الريبي في النطاق من 21-25 النيوكليوتيدات9) التي تم تناولها بالخلايا البطانية البشرية. ميرناس في المركبات الكهربائية شكل مستقر معقدة مع Ago2 (عضو لإسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي معقدة)، التي بمجرد تسليمها إلى الخلايا المتلقية، وهو قادر على إسكات الجينات على وجه التحديد والتي تؤثر على خصائص الخلايا10الحاجز. وقد وضعت البروتوكولات القياسية للتحقيق في وظيفة المركبات الكهربائية. وهنا يصف لنا أولاً بروتوكول يسمح للعلامات الفلورية للمركبات الكهربائية للتحقيق على امتصاص الخلايا المتلقية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مجهر [كنفوكل]، من الممكن تتبع مصير EV داخل الخلية. يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية لتعقب المركبات الكهربائية. صبغ أمين المتفاعلة واستر اسيتات-(and-6)-كاربوكسيفلوريسسين 5 سوكسينيميديل (CFSE) ونيون كالسين-صباحا تصبح مرة واحدة داخل الحويصلات. نحن نفضل استخدام التسمية أمفيفيليك، بخ، لأنه يعطي إشارة أكثر إشراقا وأكثر توحيدا. هذا النهج يوفر معلومات هامة فهم التفاعلات بين المركبات الكهربائية والخلايا المتلقية. بينما في بعض الحالات ربط المركبات الكهربائية على سطح الخلايا، سرعة قصرت بعض الحويصلات. عند امتصاص، يسلم المركبات الكهربائية على الشحنات إلى الخلايا، التي كانت تمارس مهامها التنظيمية.
هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لقياس وظيفة حاجز غشائي الخلايا في المختبر بالتحديد الكمي لنقل ديكستران الفلورسنت من خلال أحادي الطبقة خلوية. ويمكن استخدام تتبع أكثر حساسية مثل علامات راديولابيليد. ومع ذلك، أنها تتطلب احتياطات سلامة خاصة للاستخدام. توجد فحوصات أخرى لقياس وظيفة الحاجز في المختبر مثل المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال (طير)، الذي يقيس سلامة مفرق ضيق. وأخيراً تصور زوي-1، بروتين مفرق ضيق، قبل الفلورة يسمح تقييم سلامة مفرق ضيق ك جيدا10. وبالمركبات الكهربائية كيانات معقدة وغير متجانسة تحتوي على شحنات عدة مع الخصائص التنظيمية المحتملة، من المفيد أوفيريكسبريس الحمض النووي الريبي محددة لدراسة تأثيرها على الخلية المتلقية. ولذلك، نحن أيضا تعريف بروتوكول الذي يهدف إلى إنشاء خطوط الخلايا مستقر معربا عن ميرنا لفائدة10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على كرات الدم الحمراء البشرية من دم المانحين صحي، وفقا للمبادئ توجيهية سويسيثيكس (swissethics.ch).
ملاحظة: الإنتاج EV و المنجلية الطفيلي الثقافات (3 7) وصفت سابقا في مباجوو، وآخرون. 11 لأن المنجلية هو مسببات الأمراض بشرية، استشارة اللوائح المحلية للمناولة. الثقافات ينبغي أن تظل عقيمة الكامل الوقت.
1-الأسفار وسم من المركبات الكهربائية
ملاحظة: الإجراء التالي يستفيد من التكنولوجيا التوسيم لإدماج ستابلي صبغة فلورسنت خضراء (PKH67) مع ذيول الاليفاتيه كبيرة في منطقة الدهنية في غشاء EV. يتم تنفيذ رد فعل في 200 ميليلتر نهائي تلطيخ وحدة التخزين التي تحتوي على تركيز PKH67 نهائي 20 ميكرومتر. تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية)
- المكان 100 ميكروغرام من المركبات الكهربائية في 1 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- الطرد المركزي EVs في أنبوب ميكروسينتريفوجي بأقصى سرعة ممكنة (20,000 س ز) لمدة 7 دقائق بيليه.
ملاحظة: منذ هيموزوين غير موجودة في المركبات الكهربائية، ينبغي التقيد بيليه البنى أحمر داكن. إذا كانت المادة طافية المحمر، ثم أن تفكيك EVs. - بعد الطرد المركزي، نضح المادة طافية بعناية، من أجل تجنب إزالة أي المركبات الكهربائية.
ملاحظة: تقليل الكمية من المخزن المؤقت المتبقية قبل ريسوسبيندينج المركبات الكهربائية في مادة ج بغية زيادة إمكانية تكرار نتائج وكفاءة لتلطيخ. - ريسوسبيند بيليه EV في 100 ميليلتر من مادة (ج) (2 × تعليق EV) ولطف بيبيت لضمان تشتت كاملة.
- إعداد أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة وإضافة 4 ميليلتر من الحل صبغ اثانوليك PKH67 إلى 100 ميليلتر من مخفف دوامة جيم جيدا لخلط. إعداد هذا الحل صبغ 2 x (40 ميكرومتر) مباشرة قبل التلوين.
ملاحظة: لتجنب تلطيخ غير المتجانسة، لا تضف الحل صبغ اثانوليك PKH67 مباشرة إلى بيليه EV. - سرعة، تجمع بين 100 ميليلتر من 2 × تعليق EV (الخطوة 1، 4) 100 ميليلتر من 2 × صبغ الحل (الخطوة 1، 5). ثم تخلط العينة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات.
- احتضان تعليق EV/صبغ من الخطوة 1، 6 لمدة 5 دقائق محمية من الضوء ومزيج من فورتيكسينج 3-4 مرات أثناء الاحتضان 5 دقيقة.
ملاحظة: تفرخ تعليق EV/صبغ لأوقات أطول يوفر أي ميزة, لتلطيخ السريع حتى. - وقف رد الفعل المصبوغة بإضافة وحدة تخزين تساوي (200 ميليلتر) من المصل، واحتضان لمدة 1 دقيقة للسماح لربط صبغة الزائدة.
ملاحظة: قبل إيقاف تلطيخ، تستنزف المصل من المركبات الكهربائية باستخدام الطرد المركزي في 20,000 ز x لمدة 20 دقيقة. - أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وتدور إلى أسفل في ز 20,000 x للحد الأدنى 5 ريسوسبيند EVs في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للوصول إلى نهائي تركيز 1 ميكروغرام/ميليلتر.
2-تصور الإقبال على المركبات الكهربائية بالفحص المجهري [كنفوكل]
ملاحظة: يصف البروتوكول التالية تتبع لاستيعاب EV غشائي الخلايا المزروعة في كوفيرسليبس الزجاج. خلايا بطانية تكون مخلدة شبه خلايا "بطانية نخاع العظام" البشرية كما هو موضح في12.
- العمل في بيئة معقمة، معطف كوفيرسليبس مع وجود فائض من 0.01 ٪ بولي-L-يسين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- نضح الحل بولي-L-يسين والسماح كوفيرسليبس لتجف تماما.
- نفذ عدد خلايا غشائي قابلة للتطبيق استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير.
- نقل 1 × 105 خلايا بطانية في 1 مل من كامل "غشائي خلية النمو المتوسطة" المحتوية على "مزيج الملحق" كوفيرسليبس بولي-L-يسين-المغلفة وترك الخلايا تنمو إلى أحادي الطبقة.
ملاحظة: المتوسط تحتوي على عوامل النمو التي تسمح للخلايا شكل أحادي الطبقة وأن تشكل تقاطعات ضيق. - وبمجرد تشكيل الخلايا أحادي الطبقة، بعناية نضح على المديين المتوسط وإضافة 1 مل متوسط الطازجة وتغسل الخلايا. تكرار الغسيل مرة أخرى. إضافة 50 ميكروغرام من المركبات الكهربائية المسمى PKH67 واحتضانها ح 4.
ملاحظة: للبحث عن نقطة الوقت الأمثل للامتصاص، يمكن إجراء دورة وقت. - بعد ح 4، نضح المتوسطة، وتغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة المركبات الكهربائية الزائدة وغير منضم. إصلاح الخلايا مع الحل بارافورمالدهيد 3% في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يمكن أن تعطل الميثانول أكتين أثناء عملية التثبيت؛ ولذلك، فمن الأفضل لتجنب أي الميثانول تتضمن نسيجية أو نسيجية أخرى على أساس مذيب. من المستحسن استخدام فورمالدهايد خالية من الميثانول كما مثبت. - تغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. أضف بعناية 250 ميليلتر من 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني بيرميبيليزي الخلايا. تبني على RT لمدة 5 دقائق.
- أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 400 ميليلتر حظر المخزن المؤقت (5% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة على RT كتلة غير محددة ملزمة.
- تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إعداد الحل المصبوغة بتمييع ميليلتر 5 من الحل فالويدين الأسهم في 200 ميليلتر PBS/1% جيش صرب البوسنة الواحدة وكل كشف الغطاء. بيبيت 200 ميليلتر الحل المصبوغة على ساترة واحتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت
- أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. كونتيرستين الحمض النووي لمدة 30 ثانية مع هويشت 33342 بتركيز نهائي 2 ميكروغرام/مل في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- يغسل 2 x ساترة بإضافة 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. الاستيلاء ساترة مع الملقط وعكس ذلك على رأس قطره أنتيفادي تركيب وسائط على شريحة زجاج بعناية. قم بإزالة الوسائط الزائدة مع أنسجة بلطف وختم كل جانب بطلاء الأظافر.
- تخزين الشرائح محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
- تصور الخلايا باستخدام مجهر [كنفوكل] ليزر الجسيمات 405 و 488 و 543 نانومتر و 63 X، 1.3 الهدف النفط نا مع انبعاثات الفلورسنت في شمال البحر الأبيض المتوسط 450-470 (أزرق) و 505-530 نانومتر (الأخضر) 620 نانومتر.
ملاحظة: تظهر النتائج النموذجية واكتين المصبوغة في الشكل 1.
3. نفاذية الخلية بطانية
ملاحظة: يتم تقييم نفاذية الخلية البطانية بقياس نقل والرودامين ب isothiocyanate-ديكستران (متوسط ميغاواط 70,000) عبر أحادي الطبقة غشائي خلية. ديكستران يوفر أداة ممتازة لدراسة نفاذية الأوعية الدموية.
- عد الخلايا غشائي قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق 0.4 في المائة وهيموسيتوميتير.
- لوحة خلايا بطانية في كثافة 0.6 × 105 خلايا لالتقاء في إدراج زراعة الأنسجة 24-جيدا (0.4 حجم المسام ميكرومتر) وإجازة دون عائق لمدة 5 أيام على الأقل لتشكيل مونولاييرس المتباينة. قم بتحديث في المتوسط كل يوم الثاني.
- حالما تصل الخلايا إلى أحادي الطبقة، تحميل EVs (50 ميكروغرام في 1 مل) في مجلس الشيوخ. إضافة والرودامين-ديكستران إلى أعلى البئر بتركيز 20 ملغ/مل نهائي. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- مراقبة نقل ديكستران الفلورية إلى الأسفل جيدا بقياس الانبعاثات الأسفار من 40 مختبرين المتوسطة ميليلتر. إعداد القارئ الميكروسكوبية تسميات متعددة في 544 نيوتن متر الإثارة و 590 nm الانبعاثات للقياسات.
ملاحظة: مقدار ديكستران منتشر يمكن قياسها كمياً باستخدام منحنيات المعايرة المنشأة مع الحل الأسهم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء التجارب الحركية عن طريق إزالة عينات صغيرة من الوسط الخارجي الدائرة خلال دورة وقت (الشكل 2). حتى بدون أي علاج، وسوف منتشر ديكستران عن طريق أحادي الطبقة خلية.
4-تحديد حساسية بوروميسين
ملاحظة: قبل ترانسدوسينج خطوط الخلايا مع lentivirus، من المهم تحديد منحنى تقتل المخدرات المحدد لهذا الخط خلية معينة. لتحديد الحد الأدنى لتركيز العقاقير اللازمة لقتل كافة الخلايا، إجراء تجربة استجابة جرعة باستخدام جرعات تدريجية من الدواء المحدد. لأن كل خط الخلية الثديية لديه حساسية مختلفة، قبل التجريب، ينبغي تحديد تركيز الأمثل للمضادات الحيوية النامية قتل منحنى المعايرة كما هو مفصل أدناه.
- عد الخلايا باستخدام في هيموسيتوميتير. ريسوسبيند الخلايا البطانية بتركيز 1 × 105 خلايا/مل في الكامل "المتوسطة النمو غشائي خلية" تحتوي على "مزيج الملحق".
- بلايت 1 × 104 خلايا في لوحة 96-جيدا في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر من "متوسط نمو الخلية بطانية".
- إضافة 100 ميليلتر من المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية للحصول على تركيز 0.1-10 ميكروغرام/مل (انظر الشكل 3).
- دراسة جدوى خلية كل يومين تحت مجهر خفيفة استخدام هدفا X 20. الثقافة الخلايا لمدة 10-14 يوما واستبدال الوسائط التي تحتوي على بوروميسين كل 2-3 أيام تبعاً لنمو الخلايا.
- إضافة 10 ميليلتر/كذلك "كاشف النظام التجاري المتعدد الأطراف" في كل بئر، مزيج، واحتضان ح 4 في 37 درجة مئوية في ظروف الثقافة القياسية.
- اهتزاز اللوحة بإيجاز على شاكر وقياس امتصاص الخلايا غير المعالجة وغير المعالجة باستخدام قارئ لوحة في 490 نيوتن متر (الشكل 3).
5-توصيل خلايا بطانية مع ناقل لينتيفيرال
- بلايت 1 × 105 خلايا بطانية في 1 مل متوسطة كاملة قبل توصيل اليوم. تنفيذ توصيل عندما وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي 50-80%.
- ذوبان الجليد lentivirus على الجليد، ومختبرين لمخزونات الفيروسية لتجنب تجميد أذاب دورات. تدور أسفل المواد 200 x ز لمدة 30 ثانية، في الأنابيب قبل فتح لتجنب تسرب أكثر.
- إضافة بروميد هيكساديميثريني للخلايا بتركيز نهائي 8 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: يساعد بروميد هيكساديميثريني كفاءة توصيل، لكن في بعض الحالات قد تكون سامة للخلايا. ولذلك، ينبغي تحديد تركيز الأمثل عن طريق إجراء منحنى قتل قبل توصيل. - دوامة اللوحة برفق لخلط. إضافة الكمية الملائمة من الجسيمات الفيروسية (ما بين 0.5-2 × 106 الجسيمات) في تعدد مناسبة للعدوى (وزارة الداخلية) ودوامه اللوحة برفق لمدة 30 ثانية لمزيج.
- الطرد المركزي خليط الجسيمات الخلية الفيروسية في أجهزة الطرد المركزي في RT لمدة 45 دقيقة في ز 300 x لزيادة كفاءة توصيل. احتضان خليط الجسيمات الخلية الفيروسية في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة بعناية المتوسطة التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية وتجاهل على نحو ملائم. استبدلها بالمتوسطة ثقافة كاملة طازجة والمعالجون مسبقاً.
- بدء التحديد مع بوروميسين في اليوم الثاني: إزالة المتوسطة واستبدالها بالطازجة المتوسطة التي تحتوي على تركيز الصحيح من بوروميسين كما هو محدد مسبقاً في القسم 4 (الشكل 3).
- حصاد الخلايا بعد التحديد بوروميسين وعزل الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي عزل مجموعة اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- إجراء توليف كدنا مع المحدد كيت ميرناس باستخدام نسخ عكسي (انظر الجدول للمواد).
- قم بإعداد رد فعل qPCR وفقا للبروتوكول المذكور13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، يمكننا وصف بروتوكولات للتحقيق في تفاعلات المركبات الكهربائية مع الخلايا المضيفة. ويرصد الإقبال على المركبات الكهربائية المسمى فلوريسسينتلي المجهري [كنفوكل] (الشكل 1). خلايا بطانية كفاءة تناول المركبات الكهربائية، لكن وقت الحضانة مع المركبات الكهربائية يمكن أن يكون الأمثل لتتبع في الإقبال. لتعريب أفضل من المركبات الكهربائية داخل الخلايا، وصمة عار الأكتين مع فالويدين. وبعد ذلك، نستخدم غشاء تصفية على رأس الذي ينمو أحادي الطبقة خلايا بطانية. يتم تطبيق والرودامين ب isothiocyanate-ديكستران في قاعة أعلى من غشاء التصفية وثم يتم قياس نفاذية أحادي الطبقة غشائي برصد نقل ديكستران الفلورية إلى الدائرة السفلي (الشكل 2A). عادة ما يتأثر نفاذية الخلايا البطانية عند الاحتضان مع كمية متزايدة من المركبات الكهربائية (الشكل 2). من المهم أن تنمو الخلايا لعدة أيام للتأكد من أنها ستشكل من أحادي الطبقة، خلاف ذلك سوف منتشر الصبغة بسرعة عن طريق الآبار. من المهم أن نلاحظ أنه حتى بدون علاج، ديكستران سوف منتشر ببطء عن طريق أحادي الطبقة الخلية.
ميكرورناس هي المكونات الرئيسية للمركبات الكهربائية، وبعد نقل الخلايا المتلقية، وأنهم تنظيم التعبير الجيني. من أجل التحقيق في دور ميرناس على وجه التحديد، فإنه مفيد جداً أوفيريكسبريس لهم في خط الخلية المتلقية. هنا ونحن تصف كيفية ترانسدوسي ميرناس إلى خلايا بطانية. الخطوة الأولى تتألف من تحديد تركيز بوروميسين الذي يقتل خلايا بطانية من أجل تحديد الخلايا ستابلي ترانسدوسيد (الشكل 4 أ). أخيرا، يمكن الخاضعة لمستوى التعبير عن ميرناس ويصادق عليها قبكر (الشكل 4 باء).
الشكل 1: يتم تناول المركبات الكهربائية بخلايا بطانية. كانت المسمى تنقية المركبات الكهربائية في الأخضر مع PKH67، والمحتضنة ح 4 مع أحادي الطبقة خلايا بطانية. خلايا بطانية غير المعالجة تستخدم كعنصر سلبي. بعد الغسيل واسعة النطاق لإزالة المركبات الكهربائية غير منضم، كانت ملطخة الخلايا فالويدين وصمة عار أكتين (أحمر) وهويشت 33342 وصمة عار النواة (أزرق). ولوحظت الخلايا بالميكروسكوب [كنفوكل]. أخذت الصور باستخدام مجهر ليزر [كنفوكل] وهدف نفط نا 63 x 1.3. هو متحمس هويشت 33342 في 405 نانومتر ومع الانبعاثات التي يتم جمعها في شمال البحر الأبيض المتوسط 450-470 (أزرق)؛ PKH67 هو متحمس في 488 نانومتر، الانبعاثات التي يتم جمعها في 505-530 نانومتر (الأخضر)؛ وهو متحمس فالويدين-594 في 543 نانومتر، الانبعاثات التي يتم جمعها في 620 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تأثير امتصاص EV على حاجز غشائي. التخطيطي (A) لنشر المسمى والرودامين ديكستران: تزرع خلايا بطانية لالتقاء على رأس غشاء تصفية، ديكستران نيون يتم تطبيقها على الدائرة أعلى، وينشر على مر الزمن من خلال الغشاء. ويتم تقييم تأثير المركبات الكهربائية على نفاذية بعد إضافة المركبات الكهربائية للدائرة العليا بقياس معدل انتشار ديكستران إلى الدائرة السفلي. (ب) زيادة كمية المركبات الكهربائية هي المحتضنة مع خلايا بطانية. نقل المسمى والرودامين ديكستران عبر غشاء ترانس-جيدا مع مرور الوقت يسمح بقياس النفاذية. هو زيادة نفاذية عبر الطبقة غشائي كبيرة بعد ح 2 من الحضانة مع 50 و 100 ميكروغرام/مل من المركبات الكهربائية. وتمثل البيانات يعني (± s.e.m.) من 3 تجارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: معايرة بوروميسين- هو إضعاف الأسهم حل بوروميسين (10 مغ/مل) في 1640 RPMI تستكمل مع مصل العجل 10% معطل الحرارة (56 درجة مئوية، 30 دقيقة) الجنين، الجلوتامين 2 مم، بيروفات صوديوم 1 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين. يتم إضافة ما مجموعة 15 ميليلتر إلى 10 مل متوسطة في أنبوب ألف ثم مختلطة 7.5 مل الحل من الأنبوب A إلى 2.5 مل ربمي لأنبوب باء أخيرا، تتم إضافة 100 ميليلتر من إضعاف إلى 100 ميليلتر من الخلايا لإعطاء تركيز نهائي من 7.5 ميليلتر/ملليلتر، 5.62 ميليلتر/ملليلتر وهلم جرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: توليد خلايا بطانية أوفيريكسبريسينج miR451a. (أ) تحديد منحنى القتل بوروميسين في خلايا بطانية. خلايا بطانية كانت المحتضنة مع بوروميسين في زيادة الجرعات. وتم قياس صلاحية بفحص النظام التجاري المتعدد الأطراف بعد 72 ساعة. وتمثل البيانات يعني (± s.e.m.) من تجربة تمثيلية واحدة. (ب) الكشف المستمدة من غشائي الخلايا overexpressing miR451a أو عنصر تحكم سلبية تم حصادها ونسخة miR451a كان كمياً "بكر في الوقت الحقيقي". نتائج qPCR هي تطبيع بواسطة الأسلوب 2-Ct استخدام U6 كجين مدبرة منزل وأعرب عن يعني (± s.e.m.) (n = 3 تجارب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطفيليات عدة، بما في ذلك التوكسوبلازما ومثقبيه ليشمانيا المشعرة يؤدي إلى الإفراج عن المركبات الكهربائية بالخلية المضيفة المصابة. اعتماداً على مسببات الأمراض، يمكن أن تعدل الاستجابة المناعية المضيف EVs المفرج عنهم أو التوسط في الاتصالات الخلوية بين الطفيليات6. حتى الآن، هناك القليل من الأدلة التي تشير إلى كيف تسهم هذه الحويصلات الصغيرة لمرض الملاريا. هنا، لقد قمنا بوصف عدة طرق للتحقيق وظيفة المركبات الكهربائية أثناء الإصابة المتصورة . على سبيل المثال، يمكن رصد امتصاص المركبات الكهربائية بالخلايا المتلقية في فيفو كفاءة بوصفها لهم بصبغة الفلورسنت PKH67. وقد العديد من الضوابط التي يتعين القيام بها لضمان خصوصية العلامات. من المهم أن نلاحظ أن مجرد مختلطة مع ج مادة، صبغ PKH67 يميل إلى نموذج المجاميع، ولذلك من الضروري تضمين عنصر تحكم مع صبغ وحدها دون المركبات الكهربائية لتحديد تلطيخ غير محددة. مجهرية [كنفوكل] هو الأسلوب المفضل للتفريق بين حويصلات منضمة إلى السطح واستيعابه حقاً بالخلايا المتلقية. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يوفر أداة ممتازة لتتبع ورصد عدد الحويصلات بالخلايا. ومع ذلك، مازال من غير الواضح كيف تتم معالجة المركبات الكهربائية في الخلايا المتلقية14؛ ولذلك، أداء دورة وقت استخدام النقاط الزمنية من 2 و 4 و 8 ح، قد تكون مفيدة للغاية من أجل تحديد الشروط المثلى لامتصاص. إضافة علامات سوبسيلولار المقصورة يمكن أن يستخدمها لتعقب المركبات داخل الخلايا مجهرية [كنفوكل]. لقد ثبت امتصاص EV تحدث عبر غشاء الانصهار أو الالتقام15. يمكن رصد الانصهار بالمركبات الكهربائية وضع العلامات مع أوكتاديسيل والرودامين ب (R18). انصهار المركبات الكهربائية مع نتائج الأغشية الخلوية في تمييع R18، الأمر الذي يؤدي إلى زيادة في الأسفار16. يمكن دراسة الإقبال على المركبات الكهربائية الالتقام باستخدام مثبطات محددة من أكتين، وميكروتوبولي، ودينامين10.
لدراسة علم وظائف الأعضاء من المركبات الكهربائية، من الممكن تسمية إيربكس مباشرة مع الأصباغ بخ وثقافة المشاركة إيربكس مع خلايا بطانية. والمشكلة هنا هي أن الخلايا تحتاج إلى وسائل الإعلام المختلفة والتراكيب الغاز وكمية نقل EV قد تكون منخفضة. وعلاوة على ذلك، يمكن التعبير عن حويصلية بروتينات تنصهر مع علامة مضيئة في الجهات المانحة الخلايا في المختبر و في فيفو. ولكن حتى الآن فإنه لم يتم اختباره مع إيربكس
كرات الدم الحمراء المصابة سيتوادهيرينت إلى ميكروفاسكولاتوري الدماغ، في عملية يعتقد أن المسؤولين تسبب الملاريا الدماغية17. ولذلك، نقل المواد الطفيلي عبر المركبات الكهربائية من المرجح أن تؤثر على خلايا بطانية ووظيفة الأوعية الدموية ومن ثم18. الفحص في المختبر الموصوفة هنا، يوفر طريقة سهلة للتحقيق في بعض الخصائص الأساسية لخلايا بطانية، كما هو الحال مثلاً في نفاذية19. اختبار إضافية مثل طير أو إيمونوستينينج مع تسو قوي-1 يمكن أن توفر المزيد من المعلومات حول سلامة مفرق ضيق10.
وعلاوة على ذلك، النموذج في المختبر تبين أن يكون أداة قوية دراسة الآليات الجزيئية وراء الاتصالات الخلوية بين الطفيليات والخلايا المضيفة. بالإضافة إلى الإقبال، يسمح هذا الإعداد التحري عن الآليات الجزيئية المعنية في هذه العملية. على سبيل المثال، لقد رصدنا نقل miR451a إلى الخلايا يقبلون PCR الوقت الحقيقي وتهجين الفلورسنت في الموقع . بالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف كيفية إنشاء خطوط الخلايا overexpressing ميرنا خاصة، التصدي مباشرة لدور هذه رنا الصغيرة في الأوعية الدموية الدالة10. ومع ذلك، ينبغي إجراء العديد من الضوابط بما في ذلك اختبار الخلايا غير ترانسدوسيد، نظراً لتوصيل نفسها قد تؤثر على وظيفة الخلوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام مثبطات ميرنا لتحييد أثر ميرناس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة كان دعم مالي في جزء من مؤسسة نوفارتيس الطبية-والبحوث البيولوجية (ليم) غوتفريد وجوليا بانجتر-رهينير-ستيفتونغ (إلى ميغاواط ويم) ومجمع البحوث جامعة فريبورغ (ليم). منح إضافية تشمل "المنح الحكومة السويسرية على التميز" "الباحثين الأجانب" (لكاب و SM). ونحن نشكر سولانج كروبي هيس وفلي إيزابيل للدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E.
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
