Summary
Мы описываем протокол для обнаружения моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранных белков с помощью связывания рецептора сортировки, sortilin, в первый цикл Люминал белка транспортера глюкозы, GLUT4, в качестве примера.
Abstract
Наша способность исследовать белок белковых взаимодействий является ключом к пониманию нормативных соединения в ячейке. Однако обнаружение белок белковых взаимодействий во многих случаях связано с значительным экспериментальных задач. В частности сортировки рецепторов взаимодействуют с их белков груз в просвете мембраны отсеков часто в моющих средств чувствительных Мода, делая co иммунопреципитация этих белков непригодным для использования. Связывание сортировки sortilin рецептор для транспортера глюкозы, что GLUT4 может служить примером слабых Люминал взаимодействий между мембранных белков. Здесь мы описываем быстрый, простой и недорогой пробирного для проверки взаимодействия между sortilin и GLUT4. Для этого мы разработали и химически синтезированных myc тегами пептид, соответствующие потенциальные sortilin привязки epitope Люминал частью GLUT4. Sortilin, отмеченных 6 гистидинов была выражена в mammalian клетках и изолированы от lysates клетки с использованием кобальта бусины. Sortilin, иммобилизованных на бисер был инкубировали с пептидной решения в различных рН, и eluted материал был проанализирован Западный blotting. Этот assay может быть легко адаптирована для изучения других моющих средств чувствительных белок белковых взаимодействий.
Introduction
GLUT4 — это белок транспортера глюкозы, которая выражается главным образом в жира и скелетных мышечных клеток, где он опосредует влияние инсулина на пост натощак крови глюкозы Распродажа1. Будучи очень стабильного белка, GLUT4 регулируется на столб-поступательные уровне. В отсутствие инсулина, GLUT4 значительной степени исключены из плазматической мембраны (отсюда низкая базальная проницаемость для глюкозы) и локализуется преимущественно внутри клетки в небольших инсулин отзывчивым везикулы (IRVs) и транс Гольджи сети (TGN), которая может представлять IRV доноров отсек. После инсулина администрации IRVs предохранитель с плазматической мембраны и доставить GLUT4 на сайт своего функционирования. Это увеличивает проницаемость мембраны плазмы для глюкозы, так что поглощение глюкозы из крови в адипоциты и скелетные миоциты возрастает с 10 до 40. После ухода инсулина GLUT4 включены в начале/сортировка endosomes и затем извлечь TGN, где IRVs вновь сформированных. Оба сортировки шаги в GLUT4 путь, т.е. извлечение из периферийных раннего endosomes для perinuclear TGN и формирование IRVs на доноров TGN мембраны включены членов семьи Vps10p, sortilin, который представляет тип I трансмембранный белок и сортировки рецептора. По словам одной модели, sortilin работает как белка трансмембранного эшафот: он связывает GLUT4 в просвете endosomes и TGN и нанимает адаптеров retromer или Клатрин цитоплазматических сторону доноров мембраны через его C-конечная2, 3. Это облегчает распространение GLUT4 в везикулярного перевозчиков, которые перемещают GLUT4 между внутриклеточным отсеков.
Взаимодействие цитоплазматических хвост sortilin с retromer и различных адаптер белков хорошо задокументировано. Однако связывание sortilin GLUT4 (и некоторые из его других лигандов белка) было сложно доказать. В частности попытки co-immunoprecipitate sortilin и GLUT4 не были успешно вероятно из-за моющих средств чувствительных характер взаимодействия между этими двумя белков. Кроме того, как типичный транспортер белок GLUT4 имеет 12 трансмембранных доменов и просветный 6 петель любое сочетание которых потенциально могут представлять sortilin привязки сайта. В то же время большой объем косвенных доказательств, например значительное совместное локализации в ячейке, сшивки с проницаемой мембраны DSP, а также взаимодействие в дрожжей два гибридной системы показывают, что sortilin можно привязать к GLUT4. Кроме того используя последний подход в сочетании с аланина, сканирование мутагенеза, мы ранее определили, что домен Vps10p sortilin связывается главным образом первый Люминал петля GLUT4. Однако доказательства такого взаимодействия в mammalian клетках был пропавших без вести. Здесь, мы выделили его меткой sortilin из transfected 3T3-L1 клеток с использованием кобальта смолы и продемонстрировал, что он может взаимодействовать с химически синтезированных пептидов, соответствующий первой Люминал цикла GLUT4 на pH 6 и рН 8, напоминающие кислой среды в от англ люмен и нейтральной среде в просвете TGN мембран. Привязка не пептид был обнаружен в управления экспериментов, где экстракт, приготовленный из не transfected клеток был загружен на же бисер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. обработка пептида
- Дизайн и заказ пептида
- Выберите нужную последовательность пептида и добавить метку, например myc epitope (EQKLISEED) на ее либо N - или C-terminus.
- Проверьте предсказал растворимость пептида в воде, используя пептиды растворимость калькулятор http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. В случае низкой растворимости, попробуйте добавить еще один водорастворимый тег, чтобы изменить баланс заряда.
Примечание: Мы использовали пептид, соответствующий первого цикла Люминал (fll) из GLUT4, отмеченных myc epitope (жирный шрифт) в отеле terminus N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA, который имеет «хорошее» предсказал растворимость в воде . - Заказать пользовательские пептид с по меньшей мере 75% чистоты, который является достаточным для assay и попросить поставщика для теста растворимости. Разделите по крайней мере два аликвоты в случае непредвиденных проблем с растворения пептида порядок.
Примечание: В двух аликвоты было приказано Myc-fll-GLUT4. Его сообщения о растворимости в воде сверхчистого является крупностью до 10 мг/мл.
- Растворяя пептида
Примечание: Ультрачистая вода является лучшим растворителем. Если пептида не растворяется в воде, обратитесь к http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html для получения инструкций.- Подготовка 100 x рабочего раствора пептида в ультрачистая вода или в буфере выбора, с концентрацией 100 мкг/мл.
- Отдельные решения в 50-100 мкл аликвоты и хранить их при-20 ° C.
2. обработка клеток
- Культура клеток
- Использование дикого типа (WT) клетки как отрицательный контроль и клетки, выражая целевого белка, отмеченных 6 гистидинов (HisP).
Примечание: Мы использовали 3T3 L1 до адипоцитов стабильно transfected с Sortilin-myc/его5. - Рост клеток в Дульбекко изменение средних орла (DMEM) высокий сахар, дополнена 10% теленка бычьим сывороточным, глютамин (2 мм) и пенициллин/стрептомицина (5 мкг/мл) при 37 ° C в 10% CO2.
- Сидят четыре блюда 10 см клеток, transfect два из них с HisP и transfect два других элемента управления плазмида (WT). 48 ч после transfection клетки должны достичь 80-90% confluency.
- Использование дикого типа (WT) клетки как отрицательный контроль и клетки, выражая целевого белка, отмеченных 6 гистидинов (HisP).
- Подготовка Lysates клетки
- Подготовка буфера lysis (10 мм Hepes, 30 мм NaCl, 5% глицерина, 10 мм имидазола, 0,5% Тритон X-100 и протеазы ингибитор коктейль без ЭДТА для изоляции его меткой белков, рН 7,4) и держать его в 4 ° C:
- Вымыть клетки три раза с 10 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) при 4 ° C.
- Поставьте посуду на льду и 500 мкл буфера lysis к каждому блюду. Урожай lysates клетки с помощью скребка ячейки.
- Место lysate клетки от каждое блюдо в различных 1,5 мл трубку. Метки трубы как WT-pH6, WT-pH8, HisP pH6, HisP pH8.
- Передайте lysates клетки через шприц с иглой 26G пять раз вверх и вниз, полный лизис.
- Центрифуга lysates клетки на 16000 x g 10 мин при 4 ° C.
- Передать supernatants новые одинаково обозначенные трубы.
- Анализ концентрации протеина используя комплект Assay протеина BCA или других kit.
- Использование буфера lysis, уравнять концентрации белка всех четырех лизатов.
- Отдельные Алиготе малых (ОК. 20 мкл) о каждом lysate и держать его при-20 ° C для возможного контроля эксперименты и/или поиска и устранения неисправностей.
3. привязка его меткой белков к бисеру HisPur кобальта
- Использование коммерчески доступных мыть буфер или подготовить один (50 мм Na2HPO4/NaH2PO4, 300 мм NaCl, 20 мм имидазола, рН 8) и держать его на 4 ° C.
- Подготовить мыть буфер с рН 6 tittering мыть буфер рН 8 с HCl. Держите его при 4 ° C.
- Аккуратно водоворот бутылка кобальта бисера сделать однородная суспензия.
- Лунки 40 мкл бусины подвеска кобальта в четыре 1,5 мл трубки помечены как указано выше (шаг 2.2.4).
- Добавить 1 мл буфера lysis к каждой трубе и центрифуги трубы на 1000 x g для 5 s. аспирата супернатанта и добавление поселились бусины 40 мкл буфера lysis.
- Добавьте соответствующие трубы lysates клетки.
- Инкубируйте трубы 90 мин при температуре 4 ° C на вращателе трубки на 20 об/мин.
- Центрифуга трубы на 1000 x g 5 s и собирать супернатант. Держите супернатант при 4 ° C.
- Добавьте 500 мкл буфера рН 6 мыть или рН 8 соответствующие трубы и вновь приостановить бисер осторожно.
- Центрифуга для трубы на 1000 x g 5 s и отменить supernatants.
- Повторите шаги 3.9 и 3.10 четыре раза.
4. Связывание пептида его меткой белка, иммобилизованных на бисер
- С помощью рабочего раствора 100 x пептида (шаг 1.2.1), подготовить 1 x рабочих растворов в рН 6 или мыть буфер рН 8 (два 100 мкл аликвоты каждого, 1 мкг/мл).
- Добавьте 100 мкл раствора 1 x пептид промывают бусы с соответствующими pH.
- Инкубируйте Бусины для 30 мин при температуре 4 ° C на вращателе трубки на 20 об/мин.
- Центрифуга для трубы на 1000 g x 5 s, собирать супернатант и держать его при температуре-20 ° C.
- Повторите шаги 3.9 и 3.10 четыре раза.
Примечание: С целью уменьшения возможных фон, следующие шаги может заменить шаги 4.4 и 4.5. - Возьмите четыре микро столбцы с 30 мкм поры, обозначить их как шаг 2.2.4 и место столбцов в коллекции трубок.
- После завершения шага 4.3, передача смеси инкубации в столбцы, позволяют решение пройти под действием силы тяжести. Держите поток через при-20 ° C.
- Мимо 500 мкл буфера мытья с рН 6 или рН 8 через соответствующие столбцы гравитации. Слейте через поток.
- Повторите шаг 4.8 четыре раза.
- После последнего мыть, центрифуга столбцы на 1000 x g 15 s.
5. элюции из бисера кобальта
- Использование коммерческих буфер образца Трицин (200 мм трис-HCl, 40% глицерина, 2% SDS, 0,04% Кумасси синий, pH 6.8) и добавить β-меркаптоэтанол в конечной концентрации 2%.
- Добавьте 40 мкл пример буфера Трицин (с β-меркаптоэтанол) промывают бусы и вихревой образца.
- Тепло образцы для 10 минут при 100 ° C, вихрь снова, образцы и центрифуги трубы на 1000 g x 5 s.
Примечание: С целью уменьшения возможных неспецифического связывания в элюции, следующие шаги может заменить шаги 5.1-5.3. - Добавить промытый 40 мкл буфера имидазола (50 мм Na2HPO4/NaH2PO4, 300 мм NaCl, 0,25 М имидазола) бисер, вихрь и инкубировать трубы при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Центрифуга для трубы на 3000 x g для 30 s, собирать супернатант (eluted образцы) и передать его на новые помечены трубы.
- Добавить 40 мкл пример буфера Трицин каждой трубы, тепло образцы для 10 минут при 100 ° C, вихрь и центрифуги трубы на 1000 x g 5 s.
Примечание: Если используются микро столбцы, добавьте Элюирующий буфер промывают бусы, Проинкубируйте втечение 20 мин и собирать элюции центрифугированием в 8000 x g на 2 мин.
Примечание: Образцы могут храниться при температуре-20 ° C до проводится электрофорез.
6. электрофорез и Западный blotting
Примечание: Образцы готовы для разъединения SDS-PAGE и последующих Западный blotting. Следуйте протокола электрофореза геля (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) со следующими изменениями.
- Использование коммерчески доступных 10-20% Трицин градиента гели.
- На геле Загрузите eluted образцов 20 мкл и 20 мкл лизатов (шаг 2.2.10). Для устранения неполадок, рекомендуется загрузить 20 мкл несвязанного материала (шаг 3,8) и 10 нг пептида; перед загрузкой, добавьте равное количество Трицин буфер образца для этих образцов.
- Провести электрофорез в коммерческих трис/Трицин/SDS работает буфер (100 мм трис, 100 мм Трицин и 0.1% SDS, рН 8.3).
- Передача материалов из геля на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм с использованием буфера передачи (25 мм Tris база, 192 мм глицин, pH 8.4) дополнены 20% метанола.
- Блокировать мембраны с 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) за 1 ч при комнатной температуре. Используя маркеры предварительно окрашенные молекулярный вес как направляющие, горизонтально разрезать мембраны, пятно верхней части с антитело против HisP и пятно в нижней части с антитело против myc epitope для идентификации пептид myc тегами.
Примечание: В нашем конкретном случае резки мембраны не требуется поскольку HisP и Myc-fll-GLUT4 могут быть обнаружены с анти myc антитела.
7. Анализ результатов
- Количественную оценку интенсивности всех иммуноблоттинга сигналов с помощью изображения станции или ImageJ программы.
- Нормализовать сигнал от myc тегами пептид против сигнал от HisP в обоих значениях рН.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лизатов были подготовлены 3T3 L1 клетки стабильно transfected, с Sortilin-myc/его5 и от WT 3T3 L1 клеток, используется в качестве отрицательного контроля. Обе лизатов были инкубировали с бисером кобальта в рН 6 или рН 8 и тщательно промывают. Бусины с иммобилизованными белки затем инкубировали в решении Myc-fll-Glut4. После тщательного моет белки, обязан бусины были этого eluted с 0,25 М имидазола. Образцы были подвергнуты, наряду с оригинальной лизатов, чтобы SDS-PAGE в 10-20% Трицин градиента гель следуют Западный blotting с антитела анти Myc, что позволило для обнаружения оба sortilin-myc/его (110 кувейтских динаров) и Myc-fll-GLUT4 (5 kD) (рис. 1) .
Myc-fll-GLUT4 (10 нг) был загружен на первой полосе геля как ссылка. Как только 75% чистоты пептида, загрязнений являются очевидными (более высоких диапазонах). Оригинальные lysates клетки от WT и Sortilin-myc/его выражая клетки содержат несколько полос, признанные антитела анти myc. Материал изоляции от Sortilin-myc/его выражая клетки намного чище. Помимо некоторых незначительных неспецифичных, он имеет только два myc содержащих компонентов: Sortilin-myc/его и Myc-fll-GLUT4. Загрязняющие пептидов в первой полосе не отображаются для привязки к Sortilin-myc/его. Отрицательный контроль (WT элюата) имеет преимущественно неспецифичных.
Как GLUT4 проходит через внутриклеточные отсеков, таких как endosomes и TGN, которые имеют различные Люминал рН, мы хотели, чтобы оценить взаимодействие GLUT4 с sortilin на pH 6 и рН 8 (рис. 2). Денситометрия результатов (не показан) не выявило каких-либо существенных различий в соотношении между Myc-fll-GLUT4 и Sortilin-myc/его сохранена на бусы на различных рН. Таким образом, мы заключаем, что GLUT4 имеет возможность взаимодействовать с sortilin в endosomes и TGN.
Рисунок 1 . Sortilin-myc/его взаимодействия с Myc-fll-GLUT4 на кобальт бусины. Лизатов из WT 3T3-L1 клетки и клетки 3T3-L1, стабильно выражения Sortilin-myc/его (S) были переданы кобальта бусы, промывают, инкубировали с Myc-fll-Glut4 при pH 8, промывают снова и этого eluted с буфером имидазола. Myc-fll-Glut4 (10 нг) был загружен на первой полосе как ссылка.
Рисунок 2 . Sortilin-myc/его взаимодействует с Myc-fll-GLUT4 при pH 8 и рН 6. Myc-fll-Glut4 был инкубировали с материалом, иммобилизованных на бусы на pH 6 и pH 8, промывают и этого eluted с глицином буфер образца. Этот показатель был адаптирован от Pan X., et al3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sortilin-это эволюционный сохранение нескольких лигандов белка рецептора, что участвует в обоих сигналов на плазматической мембраны и внутриклеточных сортировки событий6,7. Однако поиск подлинных sortilin лигандами (некоторые из которых являются Люминал или составной мембранных белков) является сложным, как взаимодействие sortilin с некоторыми из своих партнеров привязки, как представляется, быть чувствительным к моющим средствам. Таким образом легко и широко подход для изучения взаимодействия протеин протеина, co иммунопреципитация, не могут быть применены легко. Некоторые исследовательские группы использовали co иммунопреципитация продемонстрировать взаимодействие между sortilin и ее потенциальных лигандов8,9. Однако, эти эксперименты были проведены в 0,1% тритон или 0,6% ПАРНЕЙ, которые бросает тень сомнения в полноте солюбилизация мембраны.
Другие исследователи изучали взаимодействие между sortilin и его лигандов поверхностного плазмон резонанс10,11. Хотя резонанс поверхностного плазмон, несомненно, лучший подход к проблеме, она требует дорогостоящего оборудования и значительное количество чистого рекомбинантных белков, которые является дорогостоящим и трудоемким.
Здесь мы опишем технику, которая, в сочетании с другими методами, например сшивки и дрожжей два гибридной системы, настоятельно рекомендую эту sortilin можно привязать к GLUT4. Быстро и легко и может быть легко адаптирована к других белков и различных размеров пептидов.
Есть несколько важных шагов в этом assay. Первый из них является пептид растворимость в воде. Еще один является выбор правильного управления. Очевидно значительное количество биологического материала может взаимодействовать с кобальт бусины через эндогенные его досягаемости последовательностей или неспецифически. Таким образом, крайне важно для иммобилизации на бусины лизатов WT клеток и transfected клеток с протеином интереса, в нашем случае Sortilin-myc/его. В такой экспериментальный дизайн, материал, привязан к бисеру будут отличаться только один белок, Sortilin-myc/его, так что может быть терпимо в определенной степени привязки фон пептида управления бисером. Тем не менее фон привязки пептида корда может быть уменьшены путем увеличения жесткости шагов окончательной стирки. Использование мини-колонки для мытья бисер может снизить фон привязки еще дальше.
Из-за природы «GLUT4 путь» мы хотели, чтобы адрес привязки Myc-fll-GLUT4 к sortilin на различных рН. Мы понимаем, что рН в просвете раннего/сортировки endosomes может упасть ниже 6. Однако рН ниже, чем 6 нарушает связывание его с тегами белков бисером кобальта, которые могут рассматриваться как ограничение метода.
Изоляция целевого белка на кобальт бусы, используя его epitope предпочтительнее других сродства очищения шаги, например иммунопреципитации с специфическими антителами, с точки зрения доходности и неспецифической привязки. Тем не менее, это вполне возможно, что изоляция целевого белка на любые другие смолы (желательно, магнитные бусы) с надлежащим контролем окажется успешным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательских грантов, DK52057 и DK107498 из низ K.V.K. Х.Р был поддержан институционального обучения Грант 2T32DK007201 из низ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al.
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
