أسلوب لتحديد آثار الإثراء البيئي في القولون ميكروبيومي التنوع البيولوجي في نموذج ورم القولون الماوس
Summary
الإثراء البيئي (EE) هو بيئة إسكان الحيواني الذي يستخدم للكشف عن الآليات التي تقوم عليها العلاقة بين نمط الحياة والإجهاد والمرض. ويصف هذا البروتوكول إجراء يستخدم نموذج ماوس tumorigenesis القولون وهه لتحديد التعديلات على وجه التحديد في التنوع البيولوجي الحجمية التي قد تؤثر على وفيات الحيوان.
Abstract
وقد أبرزت عدة دراسات أجريت مؤخرا الآثار المفيدة للذين يعيشون في بيئة مخصب على تحسين الأمراض البشرية. في الفئران، الإثراء البيئي (EE) يقلل tumorigenesis بتنشيط ماوس الجهاز المناعي، أو يؤثر على الورم تأثير بقاء الحيوان عن طريق حفز الاستجابة إصلاح الجرح، بما في ذلك التنوع ميكروبيومي محسنة، وورم المكروية. شرط هنا إجراء مفصل لتقييم آثار الإثراء البيئي على التنوع البيولوجي ميكروبيومي في نموذج ورم القولون ماوس. موصوفة بالاحتياطات اللازمة فيما يتعلق بتربية الحيوان واعتبارات للحيوان التكامل مستعمرة الوراثي، والماوس، وكلها تؤثر في نهاية المطاف التنوع البيولوجي الميكروبي. الإصغاء هذه الاحتياطات قد تسمح بانتقال ميكروبيومي موحدة أكثر، ونتيجة لذلك سوف يخفف آثار تعتمد غير المعالجة التي يمكن الخلط بين نتائج الدراسة. علاوة على ذلك، تتسم التغيرات الحجمية في هذا الإجراء، استخدام 16S المتاشب تسلسل الحمض النووي المعزولة من البراز التي جمعت من القولون القاصي بعد تخصيب البيئية الطويلة الأجل. القناة الهضمية الحجمية الاختلال يرتبط بأمراض سرطان القولون ومرض التهاب الأمعاء، ولكن أيضا من السمنة ومرض السكري بين السكان الآخرين. الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل هة وميكروبيومي دراسة دور ميكروبيومي المرضية عبر مجموعة متنوعة من الأمراض التي توجد فيها نماذج الماوس قوية التي يمكن إيجاز الأمراض البشرية.
Introduction
دراسات الإثراء البيئي ه (ه) استخدام معلمات السكن معقدة تؤثر على التحفيز الاجتماعي (أقفاص السكنية الكبيرة، ومجموعات أكبر من الحيوانات) والتحفيز الإدراكي (أكواخ والإنفاق، ومواد التعشيش ومنصات) والنشاط البدني (على التوالي عجلات). وقد استخدمت هة بالعديد من المعامل لفهم آثار زيادة النشاط وتحسين التفاعلات الاجتماعية والمعرفية في بدء المرض والتقدم باستخدام مجموعة واسعة من نماذج الماوس، بما في ذلك الحلاقة الحاصة المستحث، مرض الزهايمر، متلازمة ريت وأمراض الأورام والجهاز الهضمي عدة نماذج1،2،،من34،،من56.
تم تطوير عدة نماذج الماوس لدراسة tumorigenesis القولون في الفئران. ربما هو النموذج الأكثر المعالم الماوس Apcدقيقة . الماوس Apcدقيقة وضعت في المختبر من حمامة ويليام في عام 19907، وقد استخدمت كنموذج الفأر من الطفرات في الجين APC التي ترتبط عادة بسرطان القولون والمستقيم البشرية. على النقيض من البشر إيواء APC الطفرات، الفئران Apcمين أساسا تطوير أورام الأمعاء الصغيرة، مع حدوث نادرة جداً لاورام القولون. ومع ذلك، يزيد اليل Tcf4Het مع طفرة متخالف خروج المغلوب knockin واحدة في Tcf4، إلى حد كبير tumorigenesis القولون عندما جنبا إلى جنب مع اليل Apcدقيقة 8. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذا الطراز الماوس من tumorigenesis القولون لتحديد آثار هة على القولون توموريجينيسيس6. في الكاثوليكي وآخرون. دراسة آثار فسيولوجية والمظهرية هة على الذكور والإناث من أربعة خطوط الماوس المختلفة (البرية من نوع (WT)، Tcf4Het/+ Apc+ +، Tcf4+ + Apcمين/+، و Tcf4 Het/+ آسيا والمحيط الهادئمين/+)) تم تعريفها. ربما كانت النتيجة الأكثر إثارة للاهتمام أن هة يزيد بشكل ملحوظ عمر الحيوانات الحاملة لورم القولون الذكور والإناث على حد سواء. وهذا يبرهن أنه قد يقلل هة على الأقل بعض الأعراض المرتبطة tumorigenesis القولون، وتحسين صحة الحيوان. بشكل ملحوظ، هذا عمر محسنة عند الذكور ليست نتيجة مباشرة لانخفاض توموريجينيسيس، وبدلاً من ذلك يرتبط بالشروع في ورم الجرح الشفاء الاستجابة، بما في ذلك تحسين ميكروبيومي التنوع البيولوجي6.
وقد نشرت عدة دراسات محددة هة مع نتائج مثيرة للاهتمام. ومع ذلك، من وجهة النظر تقنية، نتائج هامة لا غالباً ما قابل للترجمة إلى مختبرات أخرى. الحفاظ على منهجيات هة متطابقة بين المختبرات المختلفة هو مسألة معقدة بشكل لا يصدق، ليس فقط بسبب أجهزة تخصيب والمساكن المستخدمة، لكن أيضا الفراش، الغذاء، التهوية، تربية، علم الوراثة، والنشاط في الغرفة، وبروتوكول الحيوان الاحتياجات، من بينها9،،من1011. مثال واحد هو التكامل الحيواني، حيث الحيوانات يجب ستابلي إدماجها في مستعمرة الماوس، ثم تطبيع التركيب الجيني في الخلفية، والنظام الغذائي، لتجنب آثار غير المعالجة ذات الصلة. علاوة على ذلك، استكملت دراسات هة العديد من قبل أعمال أهمية ميكروبيومي في المرض، وطريقة أن ممارسات تربية الماوس مشتركة يمكن أن تؤثر على تكوين10،ميكروبيومي القناة الهضمية12.
تربية والتنسيب الاستراتيجية والحيوان في هة يمكن أن تزيد من التوتر لم يكن تنفيذها بشكل صحيح. منذ الدراسات هة استخدام إعداد كبيرة من الحيوانات الذكور والإناث والأنماط الجينية متعددة، الإعداد التجريبية يمكن أن يكون صعباً نظراً للحاجة إلى الحيوانات من ليتر عدة تكون جنبا إلى جنب. ولذلك، وضعت تربية والفطام استراتيجية للسماح للجمع بين الحيوانات الفطام للنمط الوراثي الصحيح من ليتر مختلفة. وكان الأساس المنطقي الأساسي لهذا لتطبيع الحجمية بين ليتر والحد من التوتر عندما تم نقل الحيوانات في البيئة التجريبية. وأحيلت ميكروبيومي من السد10. توفير التنوع الميكروبي للمستعمرة، التي تم شراؤها من “مختبرات جاكسون” الإناث وإدماجها في المستعمرة لمدة شهر واحد قبل بدء التجربة9،،من1012. وكانت الإناث نحو مزيد من تطبيع ميكروبيومي التنوع البيولوجي بين الحيوانات، مساكن المشترك قبل تربية. بعد تربية والإسكان البلدية أثناء تربية القدرة على الهروب التمريض الجراء تحسين مستويات الإجهاد لرعاية الأمهات13،14، ربما تعزيز تطبيع ميكروبيومي. لمنع غير EE ذات الصلة بالآثار على ميكروبيومي، وهذا الإسكان البلدية من جميع الحيوانات التجريبية منع القتال وإضافية من الإجهاد الذي حدث عند الجمع بين العديد من الذكور من ليتر مختلفة في قفص تجريبية واحدة. وأخيراً، شملت أعدادا متساوية من الحيوانات من جميع الأنماط الجينية في الأقفاص. وهذا أتاح الفرصة للتنوع البيولوجي الحجمية محسنة عبر الأنماط الجينية، وإزالة مساهمة كوبروفاجيا (الميل للحيوان أن تستهلك البراز) أو الفوارق السلوكية الممكنة الخاصة بالنمط الوراثي للدراسة الشاملة.
يوفر هذا البروتوكول استراتيجية توسع الدراسات هة السابقة تشمل الجوانب المعروفة للبحث ميكروبيومي، بما في ذلك التكامل مستعمرة الإرسال والحيوان الحجمية لتطبيع الحجمية، لتمكين السكان ميكروبيومي موحدة أكثر بين الحيوانات التجريبية. مراعاة هذه الاحتياطات أمر ضروري نظراً لقدرة الاختلافات غير المعالجة الحجمية ذات الصلة الخلط بين نتائج الدراسة. إزالة غير هة المتصلة بالتغيرات الحجمية سوف تمكن الباحثين من تحديد دور هة تحديداً في تكوين الحجمية أثناء المرض التنمية والتقدم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح هذا الإجراء لتحليل الحجمية المعزولة من البراز بعد الإثراء البيئي عادي أو ورم مع الحيوانات. لأن هذه التجارب الكبيرة التي تنطوي على تربية للحصول على العديد من الحيوانات من جنسين مختلفين والأنماط الجينية، تطبيع ميكروبيومي بين الحيوانات قبل بدء التجربة أمر ضروري لتجنب هة غير المتصلة بآ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر ب دالي في لب الجينوميات جامعة يوتا لترتيب المكتبة، وباوتشر ك في قلب جامعة يوتا الإحصاء الحيوي للمشورة الإحصائية، والوصول إلى هذه النوى التقنية التي يدعمها معهد السرطان الوطني جائزة P30 CA042014. ووصف المشروع أيده معهد السرطان الوطني منح P01 CA073992 و K01 CA128891 ومؤسسة مكافحة السرطان هنتسمان.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
