שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול
Summary
העשרה סביבתית (EE) היא סביבת מגורים בעלי חיים המשמש כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס את החיבורים בין אורח חיים, מתח, מחלה. פרוטוקול זה מתאר הליך שבאמצעותו משתמש במודל עכבר של המעי הגס tumorigenesis, EE במיוחד להגדיר שינויים microbiota המגוון הביולוגי עשוי להשפיע התמותה בעלי חיים.
Abstract
מחקרים שנעשו לאחרונה מספר יש מאויר ההשפעות המיטיבות של המתגוררים סביבה מועשרת על שיפור מחלות אנושיות. בעכברים, העשרה סביבתית (EE) מפחיתה את tumorigenesis על ידי הפעלת המערכת החיסונית העכבר, או משפיע על הגידול הנושאת הישרדות בעלי חיים על ידי גירוי התגובה תיקון הפצע, כולל microbiome משופרים המגוון, microenvironment הגידול. בתנאי הנה הליך מפורט כדי להעריך את ההשפעות של העשרת הסביבה על הביולוגי של microbiome במודל של עכברים המעי הגס גידול. אמצעי זהירות לגבי הרבייה בבעלי חיים ושיקולים לשילוב בעלי חיים גנוטיפ ועכבר המושבה מתוארים, אשר בסופו של דבר להשפיע על המגוון הביולוגי מיקרוביאלי. ההקשבה הזהירות עשוי לאפשר שידור microbiome אחיד יותר, כתוצאה מכך להקל על תופעות התלויים-טיפול זה יכול לבלבל את ממצאי המחקר. יתרה מזאת, בהליך זה, שינויים microbiota מאופיינים באמצעות מטוסי אף-16 rDNA רצף ה-DNA מבודד צואה שנאסף המעי הגס דיסטלי בעקבות העשרה סביבתית ארוכת טווח. חוסר איזון microbiota בטן קשורה בפתוגנזה של מחלת מעי דלקתיות וסרטן המעי הגס, אלא גם של השמנת יתר וסוכרת בין היתר. חשוב, פרוטוקול זה עבור הנדסת חשמל וניתוח microbiome יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את התפקיד של microbiome פתוגנזה במגוון של מחלות שבו קיימים דגמים חזקים העכבר ניתן לסכם מחלות אנושיות.
Introduction
לימודי העשרה סביבתית (EE) לנצל את מתחם דיור פרמטרים כדי להשפיע על גירוי חברתי (דיור גדולים בכלובים, קבוצות גדולות של בעלי חיים), גירוי קוגניטיבי (בקתות, מנהרות, חומרי קינון, פלטפורמות), פעילות גופנית (ריצה גלגלים). הנדסת חשמל יש כבר מנוצל על ידי מעבדות רבות כדי להבין את ההשפעות של פעילות מוגברת ואינטראקציה חברתית, קוגניטיבית משופרת על המחלה החניכה, התקדמות באמצעות מגוון רחב של דגמים העכבר, כולל התקרחות המושרה barbering, מחלת אלצהיימר, תסמונת רט, מחלת סרטן, העיכול מספר מודלים1,2,3,4,5,6.
מספר מודלים העכבר פותחו כדי ללמוד tumorigenesis קולון בעכברים. אולי המודל הכי מוגדרים היטב הוא העכבר ApcMin . העכבר ApcMin פותחה במעבדתו של ויליאם יונה ב 19907, שימש כמודל העכבר של מוטציות בגן APC קשורים בדרך כלל עם סרטן המעי הגס האנושי. בניגוד לבני אדם מחסה APC מוטציות, עכברים Apcמין בעיקר לפתח גידולים קטנים במעיים, עם מופע נדיר מאוד של גידולים במעי הגס. עם זאת, אלל Tcf4הט עם מוטציה יחידה של משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים knockin-נוק-אאוט ב Tcf4, במידה רבה מגדילה את המעי הגס tumorigenesis בשילוב עם אלל Apcמינימום 8. לאחרונה, מודל זה העכבר של המעי הגס tumorigenesis שימש כדי לקבוע את ההשפעות של הנדסת חשמל על המעי הגס tumorigenesis6. בייס ואח. ללמוד, את ההשפעות הפיזיולוגיות, פנוטיפי של הנדסת חשמל על זכרים ונקבות של ארבע שורות העכבר שונים (פראי-סוג (WT), Tcf4הט / + Apc+ +, Tcf4+ / + ApcMin / +, , Tcf4 הט / + ApcMin / +)) הוגדרו. אולי הממצא המעניין ביותר היה EE מגביר באופן משמעותי את תוחלת החיים של חיות נושאות המעי הגס גם זכר וגם נקבה. כך מבהירים כי הנדסת חשמל עשוי להפחית לפחות חלק מן התסמינים הקשורים tumorigenesis המעי הגס, ולשפר את בריאות בעלי חיים. למרבה הפלא, זו תוחלת חיים משופרת, זכרים אינה תוצאה ישירה של tumorigenesis מופחת, במקום זה היה קשור אתחול של פצע הגידול ריפוי תגובה, כולל microbiome משופרים המגוון הביולוגי6.
פורסמו מספר מחקרים ספציפיים הנדסת חשמל עם תוצאות מעניינות. עם זאת, מבחינה טכנית, חשוב התוצאות אינן קרובות לתרגום למעבדות אחרות. שמירה על מתודולוגיות הנדסת חשמל זהה בין מעבדות שונות הוא נושא מאוד מסובך, לא רק בשל העשרה התקנים והשיכון בשימוש, אבל גם מצעים, מזון, אוורור, הרבייה, גנטיקה, פעילות בחדר, ואת פרוטוקול בעלי חיים דרישות, בין היתר9,10,11. דוגמה אחת היא שילוב בעלי חיים, שבו חיות חייב להיות stably משולב לתוך המושבה העכבר, לכן נרמול גנטית ברקע, הרכב, כדי למנוע תופעות קשורות ללא טיפול. זה עוד רחוק, לימודי הנדסת חשמל רבים הושלמו לפני המימוש של החשיבות של microbiome המחלה, ואת הדרך המצויים גידול העכבר יכול להשפיע על ההרכב של הבטן microbiome10,12.
אסטרטגיית הרבייה והשמת חיה ב- EE יכול להגביר מתח אם לא ביצעה כראוי. מאז לימודי הנדסת חשמל לנצל מספר גדול של חיות זכר ונקבה והן מרובים אחרים, הגדרת הניסוי יכול להיות קשה נתן את הדרישה לבעלי מספר המלטות להיות משולבת. לכן, רבייה, הגמילה אסטרטגיה פותחה כדי לאפשר שילוב של חיות גמל של גנוטיפ נכונה מהמלטות שונות. הרציונל העיקרי לכך היה לנרמל את microbiota בין המלטות, כדי להפחית את הלחץ כאשר חיות הועברו אל סביבת ניסיוני. Microbiome הועבר מן הסכר10. כדי לספק מגוון חיידקים למושבה, הנקבות היו שנרכשו מחברת מעבדות ג’קסון, משולב לתוך המושבה למשך חודש אחד לפני הניסוי החל9,10,12. לנרמל נוסף microbiome ביולוגי בין חיות, הנקבות היו שיתוף housed לפני הרבייה. בעקבות גידול, דיור קהילתי במהלך גידול ואת היכולת לברוח סיעוד הגורים שיפור את רמות הלחץ של הטיפול האימהי13,14, ואולי לקדם נורמליזציה microbiome. כדי למנוע אי-EE הקשורים השפעות על microbiome, זה דיור קהילתי של חיות ניסוי כל למנוע מתח הלחימה ואת נוספים שהתרחשו כאשר שילוב של מספר זכרים מהמלטות שונות לכלוב אחד ניסיוני. בסופו של דבר, מספר שווה של בעלי חיים אחרים כל נכללו בתוך הכלובים. זה סיפק הזדמנות microbiota משופרים המגוון הביולוגי על פני אחרים, והסיר את התרומה של והמתת תינוקות (הנטייה של החיה לצרוך צואה) או הבדלים התנהגותיים אפשרי של גנוטיפ ספציפיות ללימוד הכוללת.
פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה שמרחיבה לימודי הנדסת חשמל הקודם כדי לכלול היבטים הידוע של מחקר microbiome, כולל microbiota שידור, חיה מושבת שילוב של נורמליזציה microbiota, כדי לאפשר יותר אוכלוסיות microbiome אחיד בין חיות ניסוי. ההקשבה הזהירות חיוני בשל היכולת של הבדלים microbiota קשורים ללא-טיפול וחיסול ממצאי המחקר. ביטול ללא-EE הקשורים microbiota שינויים יאפשר לחוקרים במיוחד להגדיר את התפקיד של הנדסת חשמל microbiota הרכב במהלך המחלה התפתחות והתקדמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך זה מאפשר הניתוח של microbiota מבודד צואה בעקבות העשרה סביבתית של רגילה או הגידול הנושאת חיות. כי אלו ניסויים גדולים בהם מעורבים הרבייה לקבל בעלי חיים רבים של המינים השונים, אחרים, נורמליזציה של microbiome בין בעלי חיים לפני תחילת הניסוי הוא חיוני כדי למנוע אי-EE הקשורים השפעות על microbiome המגוון הב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ב’ דאלי הליבה אוניברסיטת יוטה גנומיקה ספריית רצף, ק’ בושה הליבה אוניברסיטת יוטה ביוסטטיסטיקה וייעוץ סטטיסטי, גישה הליבות האלו טכני נתמכת על ידי פרס מכון הסרטן הלאומי P30 CA042014. הפרויקט המתוארת נתמכה על מענקים מכון הסרטן הלאומי P01 CA073992 ו K01 CA128891 ושל קרן סרטן הצייד.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
