Une méthode pour définir les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité le Microbiome du côlon dans un modèle murin de tumeur du côlon
Summary
Enrichissement de l’environnement (ERE) est un environnement de logement des animaux qui permet de révéler les mécanismes qui sous-tendent les connexions entre le mode de vie, le stress et la maladie. Ce protocole décrit un procédé qui utilise un modèle murin de la tumorigenèse du côlon et EE pour définir précisément les altérations en biodiversité microbiote qui peut-être influer sur la mortalité animale.
Abstract
Plusieurs études récentes ont révélé les effets bénéfiques de vivre dans un environnement enrichi sur l’amélioration de la maladie humaine. Chez les souris, enrichissement environnemental (EE) réduit la tumorigenèse en activant le système immunitaire de la souris, ou affecte la survie animale de la tumeur roulement en stimulant la réponse de réparation de plaie, y compris amélioré microbiome diversité, dans le microenvironnement tumoral. Fourni ici est une procédure détaillée pour évaluer les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité de la microbiome dans un modèle murin de tumeur du côlon. Précautions concernant l’élevage d’animaux et les considérations relatives à l’intégration de colonie animale génotype et de la souris sont décrites, ce qui affecte finalement la biodiversité microbienne. Tenant compte de ces précautions peut permettre plus uniforme microbiome transmission et par conséquent permettra d’atténuer des effets reliés à pas de traitement qui peuvent confondre les résultats de l’étude. En outre, dans cette procédure, microbiote changements sont caractérisés en utilisant 16 s rDNA séquençage de l’ADN isolé dans les selles prélevés dans le côlon distal après enrichissement environnemental à long terme. Déséquilibre de flore microbienne intestinale est associé à la pathogenèse du cancer de l’intestin inflammatoire maladie et le côlon, mais aussi de l’obésité et le diabète entre autres. Ce qui est important, ce protocole pour l’analyse des EE et microbiome peut être utilisé pour étudier le rôle de la pathogénèse de microbiome à travers une variété de maladies où il existe des modèles de souris robuste qui peut récapituler les maladies humaines.
Introduction
Études d’enrichissement environnemental (EE) utilisent des paramètres complexes de logement pour influer sur la stimulation sociale (logement grandes cages, grands groupes d’animaux), stimulation cognitive (cabanes, tunnels, matériaux de nidification, plates-formes) et l’activité physique (marche roues). EE a été utilisé par nombreux laboratoires pour comprendre les effets de l’augmentation de l’activité et l’amélioration des interactions sociales et cognitives sur l’initiation de la maladie et la progression à l’aide d’un large éventail de modèles de souris, y compris de l’alopécie induite coiffeur, la maladie d’Alzheimer, Le syndrome de Rett et plusieurs maladies tumorales et digestif modèles1,2,3,4,5,6.
Plusieurs modèles de souris ont été développés pour étudier la tumorigenèse du colon chez des souris. Le modèle plus bien défini est peut-être la souris ApcMin . La souris ApcMin a été développée dans le laboratoire de William Dove en 19907et a été utilisée comme un modèle de souris de mutations dans le gène APC qui sont couramment associés à un cancer colorectal humain. Contrairement aux humains hébergeant des mutations de l’APC , ApcMin souris développent principalement petites tumeurs intestinales, événement très rare des tumeurs du côlon. Toutefois, un allèle Tcf4Het avec une mutation hétérozygote knockin-knockout en Tcf4, augmente considérablement tumorigenèse du côlon lorsqu’il est combiné avec l’ allèle de ApcMin 8. Récemment, ce modèle de souris de la tumorigenèse du côlon a servi à déterminer les effets de l’ERE du côlon tumorigenèse6. Le Bice et al. étudier les effets physiologiques et phénotypiques de l’ERE sur mâles et femelles de quatre lignées de souris différentes (type sauvage (WT), Tcf4Het / + Apc+ / +, Tcf4+ / + ApcMin / +, et Tcf4 Het / + APCMin / +)) ont été définis. Peut-être les plus intéressantes conclusions était que EE augmente de manière significative la durée de vie des animaux de porteurs de tumeur du côlon mâles et femelles. Cela démontre que EE peut réduire au moins certains des symptômes associés à tumorigenèse du côlon et améliorer la santé animale. Remarquablement, cette durée de vie améliorée chez les mâles n’est pas une conséquence directe de la tumorigenèse réduite et au lieu de cela était liée à l’initiation d’une réponse, y compris le microbiome améliorer la biodiversité6tumeur de cicatrisation.
Plusieurs études spécifiques de EE ont été publiées avec des résultats intéressants. Cependant, du point de vue technique, des résultats importants ne sont souvent pas traduisibles aux autres laboratoires. Le maintien des méthodologies EE identiques entre différents laboratoires est une question incroyablement complexe, non seulement en raison des dispositifs d’enrichissement et de l’habitation utilisée, mais également literie, nourriture, ventilation, élevage, génétique, activité dans la salle et le protocole de l’animal exigences, entre autres,9,10,11. Un exemple est intégration animale, où animaux doit être solidement intégrés dans la colonie de souris, donc normaliser composition génétique de fond et le régime alimentaire, afin d’éviter des effets connexes de non-traitement. En outre, de nombreuses études EE sont achevées avant la réalisation de l’importance du microbiome dans la maladie et la façon que les pratiques d’élevage de souris commune peuvent influer sur la composition de l’intestin microbiome10,12.
Élevage animal et la stratégie de placement dans EE peut augmenter le stress si elle n’est pas effectuée correctement. Étant donné que les études EE utilisent un grand nombre de fois des animaux mâles et femelles et plusieurs génotypes, montage expérimental peut être difficile compte tenu de l’exigence pour les animaux provenant de plusieurs portées à combiner. Par conséquent, un élevage et stratégie de sevrage a été développé pour permettre une combinaison des animaux sevrés du génotype correct des portées différentes. La principale raison d’être pour cela est de normaliser la microflore des portées et à réduire le stress lorsque les animaux ont été déplacés vers l’environnement expérimental. Le microbiome a été diffusée par le barrage de10. Afin d’offrir la diversité microbienne dans la colonie, les femelles ont été achetées de Jackson Labs et intégrées dans la colonie pendant un mois avant le début de l’expérience9,10,12. Pour davantage normaliser la biodiversité microbiome entre animaux, les femelles sont conjointement logées avant la reproduction. Après la reproduction, logement communal au cours de l’élevage et la possibilité d’échapper à petits soins infirmiers amélioré le niveau de stress des soins maternels13,14, éventuellement favoriser microbiome normalisation. Pour éviter d’autres effets sur le microbiome liés, ce logement communal de tous les animaux de laboratoire ont empêché combat stress supplémentaire qui s’est produite lors de la combinaison de plusieurs mâles provenant de différentes portées dans une cage expérimentale. Enfin, un nombre égal d’animaux de tous les génotypes ont été inclus dans les cages. Cela a permis aux microbiote améliorer la biodiversité à travers des génotypes et supprimé la contribution de coprophagie (tendance de l’animal à consommer des selles) ou des différences de comportement possibles génotype spécifique à l’étude globale.
Ce protocole prévoit une stratégie qui développe des études antérieures d’EE afin d’inclure les aspects connus de recherche microbiome, y compris l’intégration du microbiote transmission et animal de la colonie microbiote normalisation, pour permettre à des populations plus uniforme microbiome entre les animaux de laboratoire. Tenant compte de ces précautions est essentielle en raison de la capacité des différences de non-traitement microbiote connexes pour confondre les résultats de l’étude. Éliminer les non-EE associés microbiote modifications permettra aux chercheurs de définir précisément le rôle de l’ERE sur la composition de la microflore durant le développement de la maladie et la progression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette procédure permet l’analyse du microbiote isolé dans les selles après enrichissement environnemental normal ou tumeur portant des animaux. Parce que ce sont de grandes expériences qui impliquent des reproducteurs afin d’obtenir de nombreux animaux de sexe différent et de génotypes, normalisant le microbiome entre animaux avant le début de l’expérience est essentielle pour éviter d’autres effets sur le microbiome liés biodiversité.
Par souci de cohérence entre les condi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions B. Dalley, dans le centre de génomique de l’Université de l’Utah pour le séquençage de la bibliothèque et K. Boucher dans le noyau de biostatistique de l’Université de l’Utah pour conseils statistiques et l’accès à ces carottes techniques pris en charge par le prix de l’Institut National du Cancer P30 CA042014. Le projet décrit a été appuyé par le National Cancer Institute subventions P01 CA073992 et K01 CA128891 et la Fondation du Cancer de Huntsman.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
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