환경 농축 (EE) 생활, 스트레스, 질병 사이 연결의 기반이 되는 메커니즘을 공개 하는 데 사용 되는 동물 주택 환경입니다. 이 프로토콜에서는 콜론 tumorigenesis EE의 마우스 모델을 사용 하 여 특별히 microbiota 생물 다양성 동물 사망률에 영향을 줄 수 있는 변경을 정의 하는 프로시저를 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
여러 최근 연구 인간의 질병 개선에 풍부한 환경에서 생활의 유익한 효과 설명 했습니다. 마우스에서 환경 농축 (EE) tumorigenesis 마우스 면역 시스템을 활성화 하는 것을 줄여 또는 종양 microenvironment에서 향상 된 미생물 다양성을 포함 하 여 상처 복구 응답을 자극 하 여 종양 베어링 동물 생존에 영향을 줍니다. 여기에 마우스 대 장 종양 모델에서 미생물의 생물 다양성에 환경 농축의 효과 평가 하기 위해 자세한 절차입니다 제공. 동물 사육 및 동물 유전자 형 및 마우스 식민지 통합을 위한 고려 사항에 관한 주의 사항 설명, 모두는 궁극적으로 미생물 생물 다양성에 영향을. 이러한 예방 조치를 주의 더 균일 한 미생물 전송, 수 하 고 따라서 연구 결과 혼동 수 비 처리 종속 효과 완화할 것 이다. 또한,이 절차에서는 microbiota 변경 다음 장기 환경 농축 원심 결에서 수집 하는 자에서 분리 된 DNA의 16S rDNA 시퀀싱을 사용 하 여 특징입니다. 본질적인 microbiota 불균형은 염증 성 장 질환과 결 장 암, 뿐만 아니라 비만 및 다른 사람의 사이에서 당뇨병의 병 인에 연관 된다. 중요 한 것은, 다양 한 인간 질병을 정리 할 수 있는 존재 하는 강력한 마우스 모델 질병에서 미생물 병 인의 역할을 연구 하기 EE 및 미생물 분석을 위한이 프로토콜을 활용할 수 있습니다.
서론
환경 농축 (EE) 연구 활용 사회적 자극 (대형 주택 새 장, 동물의 더 큰 그룹), 인지 자극 (오두막, 터널, 중첩 물자, 플랫폼) 및 신체 활동 (실행에 영향을 미칠 복잡 한 주택 매개 변수 바퀴)입니다. EE은 질병 개시 및 barbering 유도 탈모 증, 알 츠 하이 머 병을 포함 한 마우스 모델의 다양 한 배열을 사용 하 여 진행에 증가 한 활동 및 사회 및 인지 향상 된 상호 작용의 효과 이해 하는 많은 실험실에 의해 이용 되어 레트 증후군, 그리고 여러 종양 및 소화기 질병 모델1,2,,34,,56.
여러 마우스 모델 콜론 tumorigenesis 쥐에 연구 개발 되었습니다. 아마도 가장 잘 정의 된 모델은 Apc분 마우스. Apc분 마우스 19907, 윌리엄....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 유타 대학에 의해 승인에 따라 수행 했다.
1. 실험 설계 및 전자 제어 케이지 설치
참고: 참고로, 실험 설계에 대 한 개요를 보여 줍니다 (그림 1).
-
컨트롤 (NE)와 EE 케이지 설정 (그림 2).
- 북동 감 금 소를 설정 하려면, 농축 장치 부족 압력가 기존의 제어 연습장 (표 1)을 사용 합니다.
- 큰 감 금 소, 밧줄 고리 및 터널 (자료 테이블)에 맞게 충분히 큰 감 금 소 당 1 구멍을 드릴 다운 합니다.
- 강아지를 양육 하 고 EE 케이지를 설정 하려면, 두 개의 큰 압력가 연습장 소독된 밧줄 보안된 터널 및 2 소독된 플랫폼 바닥 공간 (표 1)을 연결 합니다. 전자 실험에 대 한 소독 바퀴, 터널, 이글루, 오두막, 크롤링 공, 실행....
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결과
여러 연구 결과 정신 신체 의학의 실천 건강 결과 개량 한다 설명 했다. 마찬가지로, 마우스, 환경 농축 향상 된 수명 등 종양 상처 복구6결과 향상 시킵니다. 따라서, 전자 절차는 첫 번째 실험 (그림 1)의 개시 전에 미생물을 정상화 하는 동안이 표현 형에 microbiota의 역할을 정의 하는 것을 목적으로 개발 되었다. 중요 한 것은, 모든 사육 동물의 번 식, 시작 전 적어도 한 달 동안 마우스 식민지에 통합 되어 있으며 신생아 강아지 공동 실험 전에 microbiota 전송 정상화를 하나의 큰 감 금 소에 어머니와 함께 지 내게. 동물 21, 28 일 사이, 각 유전자 형의 동등한 숫자는 투약를 중단 시킨 그들의 각각 주택, EE 또는 북동 환경 (그림 2A)으로. 16 주에 수집 .......
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토론
이 절차는 microbiota의 자 정상 또는 종양 동물 베어링의 환경 풍부를 다음에서 분리 된의 분석에 대 한 수 있습니다. 다른 남녀의 genotypes 많은 동물을 얻기 위해 사육을 포함 하는 큰 실험 이기 때문에, 필수적 이다 동물 실험의 시작 전 사이 미생물 정상화 EE 비를 피하기 위해 관련 미생물에 대 한 효과 생물의 다양성입니다.
네브라스카 및 전자 상태 사이의 일관성을 위해 번 식 과정은 모든 마우스 처음 같은 미생물에 노출 해야 하 고, 따라서, 비슷한 미생물 내용 것으로 예상 된다 위해 수행 됩니다. 그것은 가능한, 그리고 그 마우스 유전자, 미생물 구성에 영향을 줍니다. 이러한 이유로, 유전자 형 당 마우스 숫자는 대변을 소비 하는 어떤 동물 든 지는 미생물의 유사한 다양성을 발생할 것입니다 특정 조건은 NE와 EE 사이 유지 됩니다.
실험 EE를 디자인할 때 몇 가지 어려움은 명백한 있습니다. 첫째, 동물 .......
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공개 사항
저자는 그들은 충돌의 관심을가지고 선언.
감사의 글
B. 달리는 통계 조언과 국립 암 연구소 수상 P30 CA042014에 의해 지원 되는 이러한 기술 코어에 대 한 액세스에 대 한 유타 대학 생물 통계학 핵심 라이브러리 시퀀싱 및 K. 바우처에 대 한 유타 대학 게놈 코어에는 감사 합니다. 설명 하는 프로젝트는 국립 암 연구소 보조금 P01 CA073992 K01 CA128891와 사냥꾼 암 재단에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | 표준 방사선 조사 차우는 Mario Capecchi 박사와 Harlan Labs가 공동으로 제조했습니다. |
| Cell-Sorb Plus 침구 | Fangman Specialties | 82010 | 사용 전 오토클레이브. |
| 신생아를 위한 AIMS 문신 시스템 | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Aramis Micro Tattoo Kit를 포함하여 다른 동물 등급 문신 시스템 및 잉크를 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone 마우스 마이크로 아이솔레이터 시스템 케이지, AllerZone 필터 탑 및 모듈식 다이어트 전달 시스템이 완비된 | Lab Products | 82120ZF | 각 EE 케이지는 각 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF 및 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 수명 강화 장치 | 실험실 제품 | 82109ZF | 각 EE 케이지에는 각 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF 및 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" 길이 X 19-1/16" 너비 X 7-3/4" 깊이 | 실험실 제품 | 82100ZF | 각 EE 케이지는 각 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF, 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator 필터 탑 | Lab Products | 82101ZF | 각 EE 케이지는 카탈로그 # 82120ZF, 82100ZF 및 82101ZF 중 하나와 82109ZF 중 두 개가 필요합니다. 음식은 한쪽에만 있습니다. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 또는 K3332 | 케이지를 함께 연결하고 농축 |
| 그로밋에 사용 터널을 케이지에 연결 | 타 대학교 기계 공장에서 제작 | 해당 | 없음 재료가 씹는 및 오토클레이브에 내성이 있는지 확인하십시오 |
| 패스트 트랙 휠 | Bio-Serv | K3250 또는 K3251 | 마우스 이글루 및 바닥용 |
| 마우스 이글루 | Bio-Serv | K3328, K3570 또는 K3327 | 패스트 트랙 휠 및 바닥용 |
| 마우스 이글루 바닥 | Bio-Serv | K3244 | 마우스 이글루 및 패스트 트랙 |
| 마우스 오두막 | Bio-Serv | K3272, K3102 또는 K3271 | |
| 크롤 볼 | Bio-Serv | K3330 또는 K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | 목재 펄프 오두막 보호 및 중첩에 사용 |
| 접착 필름 | VWR | 60941-072 | 마우스가 탈출하는 것을 방지하기 위해 대형 케이지의 드릴 구멍을 임시로 덮는 데 사용 |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | 본 연구에서 사용한 캐비닛은 현재 공급되지 않습니다. Bio-C36은 매우 유사합니다. |
| 1.5 mL 마이크로분리 튜브- RNAse 및 DNAse 무함유 | 모든 공급업체 | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | 이 키트는 50개의 DNA 전처리를 위한 시약을 공급합니다. 대변 용해 완충액=ASL; 구아니디늄 클로라이드 용해 완충액= AL; 구아니디늄 클로라이드를 사용한 세척 버퍼 1 = AW1; 세척 버퍼 2= AW2; EDTA=AE Waterbath를 사용한 용리 완충 |
| 액(95도까지 가열 가능) | 모든 공급업체 | 대변 샘플을 세포로 94도 배양합니다. | |
| 수조 (70도까지 가열 가능) | 어떤 공급업체 | 대변 샘플의 70도 인큐베이션을 위해 | |
| 에탄올(200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| 형광측정기: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA 광범위 어세이 키트 | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB 버퍼 또는 10mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| 실험 특이적 프라이머 | 모든 공급업체 | ||
| PCR 등급 물 | 어떤 공급 업체 | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart 준비 믹스 | Kapa Biosystems | KK2601 | (1.25mL는 100rxns 허용). |
| 진단 젤 실행을 위한 Agarose | 모든 공급업체 | ||
| TapeStation, 고감도, D1000, 스크린 테이프, 트레이스 | 애질런트 | 5067-5583 | TapeStation 또는 Bioanalyzer 기기는 라이브러리 품질을 분석하기 위해 기관 유전체학 코어에서 일반적입니다. 또는 Bioanalyzer DNA1000 Chip(Agilent, 5067-1504)을 사용할 수 있습니다. |
| Agencourt AMPure XP 마그네틱 비드 | Beckman Coulter | A63880 | 마젠틱 비드 PCR 세척 - 5mL는 250개의 PCR 반응을 세척합니다. |
| 마그네틱 스탠드 | Life Technologies | AM10027 | |
| 라이브러리 준비 가이드 | Illumina | Illumina. 16S 메타게놈 시퀀싱 라이브러리 준비: Illumina MiSeq 시스템을 위한 16S 리보솜 RNA 유전자 앰플리콘 준비. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager 소프트웨어 | 무료 제공: |
| https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | 앰플리콘에 바코드를 추가하는 데 사용 |
| MicroAmp Optical 96-well 반응 플레이트 | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq 인덱스 플레이트 고정 장치 | Illumina | FC-130-1005 | |
| 접착식 투명 플레이트 씰 | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp 접착 필름 |
| v3 시약 및 이중 300 bp 판독을 사용한 MiSeq에 의한 시퀀싱 | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | 단백질 분해 효소 K의 20mg/ml에 해당. QiaAmp 키트와 함께 제공 |
| 데이터 분석 도구 | Qiime QIIME | 소프트웨어 도구 | 설치 시스템에 따라 다를 수 있으며 QIIME 웹 사이트에는 몇 가지 옵션(http://qiime.org/install/install.html)이 설명되어 있습니다. 본 연구를 위해 MacQIIME 소프트웨어 패키지 1.9.1(Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| 13.2 | Qiime | FastQ 조인 방법 | ( http://code.google.com/p/ea-utils ). 이 연구를 위해 다중 조인 쌍 끝이 http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html 사용되었습니다. Aronesty, E. ea-utils: 생물학적 염기서열 분석 데이터를 처리하기 위한 명령줄 도구. 표현 분석, 더럼, 노스캐롤라이나. (2011). |
| 단계 13.3. | Qiime | De-Novo OTU 피킹 프로토콜 | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| 단계 13.3.1. | 사용하는 OTU(Open Taxonomic Unit). | 생물정보학. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| 단계 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: 시퀀스를 템플릿 정렬에 정렬하기 위한 유연한 도구. 생물정보학. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| 단계 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, ARB와 호환되는 키메라 검사 16S rRNA 유전자 데이터베이스 및 워크벤치. Appl Environ 미생물. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). 본 연구에서는 Greengenes 버전 13_8 |
| 13.3.1이 사용되었다. 참고: | Qiime | 다중 분할 라이브러리 | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. 참고: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| 단계 13.2.2. | Qiime | 매핑 파일 http://qiime.org/documentation/file_formats.html 만듭니다 | . |
| 단계 13.2.2. | Qiime | 매핑 파일의 | 유효성을 http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html |
| 단계 13.3.3. | Qiime | OTU를 매핑 파일 http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html 에 대한 샘플 설명에 연결합니다 | . |
| 단계 13.3.4. | Qiime | 플롯 http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html 통해 분류군을 요약합니다 | . |
| 단계 13.3.5. | Qiime | Biome 요약 표 | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html 이 연구에서는 모든 샘플을 20,000 OTU로 희소화한 후 QIIME에서 알파 희박 스크립트를 사용하여 분석했습니다. |
참고문헌
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al.
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