En metode til at definere virkningerne af miljøberigelse på tyktarmen Microbiome biodiversitet i en mus tyktarmen tumoren Model
Summary
Miljømæssig berigelse (EE) er en dyr bolig-miljø, som bruges til at afsløre mekanismer, der ligger til grund for forbindelserne mellem livsstil, stress og sygdom. Denne protokol beskriver en procedure, der anvender en musemodel af kolon tumordannelse og EE specifikt angives ændringer i mikrobiota biodiversitet, der kan påvirke dyrs dødelighed.
Abstract
Flere nyere undersøgelser har illustreret de gavnlige virkninger af at leve i en berige omgivelser på at forbedre sygdom hos mennesker. I mus, miljøberigelse (EE) reducerer tumordannelse ved at aktivere mus immunsystemet, eller påvirker tumor forsynet med dyrenes overlevelse ved at stimulere sår reparation svar, herunder forbedret microbiome mangfoldighed, i tumor mikromiljø. Her er en detaljeret procedure for vurdering af virkningerne af miljøberigelse på biodiversiteten af microbiome i en mus tyktarmen tumoren model. Forholdsregler vedrørende husdyravl og overvejelser i forbindelse med dyrs genotype og mus koloni integration er beskrevet, som i sidste ende påvirke mikrobielle biodiversitet. Give agt på disse forholdsregler kan give mere ensartede microbiome transmission, og derfor vil afbøde ikke-behandling afhængige effekter, der kan forvirre undersøgelsesresultater. Yderligere, i denne procedure, mikrobiota ændringer er karakteriseret ved hjælp af 16S rDNA-sekventering af DNA isoleret fra afføring indsamlet fra den distale colon efter langsigtede miljøberigelse. Gut mikrobiota ubalance er knyttet til patogenesen af inflammatoriske tarm sygdom og kolon kræft, men også af fedme og diabetes blandt andre. Vigtigst, kan denne protokol for EE og microbiome analyse udnyttes til at studere rollen microbiome patogenese på tværs af en lang række sygdomme hvor robust musemodeller findes der kan sammenfatte sygdom hos mennesker.
Introduction
Miljømæssig berigelse (EE) undersøgelser udnytte komplekse boliger parametre, der påvirker sociale stimulation (store boliger bure, større grupper af dyr), kognitiv stimulation (hytter, tunneler, redebygning materialer, platforme) og fysisk aktivitet (running hjul). EE er blevet udnyttet af mange laboratorier til at forstå virkningerne af øget aktivitet og bedre sociale og kognitive interaktioner på sygdom indledningen og progression ved hjælp af en bred vifte af musemodeller, herunder barbering induceret alopeci, Alzheimers sygdom, RETT syndrom, og flere tumor og mave sygdom modeller1,2,3,4,5,6.
Flere musemodeller er blevet udviklet for at studere kolon tumordannelse hos mus. Måske er den mest veldefinerede model ApcMin mus. ApcMin mus blev udviklet i laboratoriet af William Due i 19907, og har været brugt som en musemodel af mutationer i APC -genet, der er almindeligt i forbindelse med menneskelige kolorektal cancer. I modsætning til mennesker husly APC mutationer, udvikle ApcMin mus primært små intestinale svulster, med meget sjældne forekomst af colon tumorer. Men en Tcf4Het allel med en enkelt knockin knockout heterozygous mutation i Tcf4, langt øger kolon tumordannelse når kombineret med ApcMin allel8. For nylig, denne musemodel af kolon tumordannelse er blevet brugt til at bestemme EE indvirkning på tyktarmen tumordannelse6. I Bice mfl. studere, EE fysiologiske og fænotypisk virkninger på hanner og hunner af fire forskellige mus linjer (wild-type (WT), Tcf4Het / + Apc+/ +, Tcf4+/ + ApcMin / +, og Tcf4 Het / + APCMin / +)) blev defineret. Måske var den mest interessante finde at EE øger levetiden for både mandlige og kvindelige kolon tumor-bærende dyr. Dette viste, at EE kan reducere i det mindste nogle af symptomerne forbundet med kolon tumordannelse, og forbedre dyrs sundhed. Bemærkelsesværdigt, denne forbedrede levetid hos mænd er ikke et direkte resultat af lavere tumordannelse, og i stedet var knyttet til indledningen af en tumor sårheling svar, herunder forbedret microbiome biodiversitet6.
Flere EE specifikke undersøgelser er blevet offentliggjort med interessante resultater. Fra et teknisk synspunkt er vigtige resultater ofte ikke kan oversættes til andre laboratorier. Opretholde identiske EE metoder mellem forskellige laboratorier er en utrolig komplekse spørgsmål, ikke kun på grund af berigelse enheder og boliger bruges, men også sengetøj, mad, ventilation, avl, genetik, aktivitet i stuen, og animalske protokol krav, blandt andre9,10,11. Et eksempel er animalske integration, hvor dyr skal stabilt integreres i mus koloni, derfor normalisere genetiske baggrund og kost sammensætning, for at undgå ikke-behandling relaterede effekter. Yderligere, mange EE undersøgelser er blevet gennemført før erkendelsen af betydningen af microbiome i sygdommen, og den måde, at fælles mus opdrætsmetoderne kan påvirke sammensætningen af gut microbiome10,12.
Avl strategi og dyr placering i EE kan øge stress, hvis ikke udføres korrekt. Da EE undersøgelser udnytte store mængder af både mandlige og kvindelige dyr og flere genotyper, kan eksperimentel opsætning være svært givet kravet om dyr fra flere kuld skal kombineres. Derfor, en avl og fravænning strategi blev udviklet for at give mulighed for kombinering af fravænnede dyr af den korrekte genotype fra forskellige kuld. Den primære begrundelse for dette var at normalisere mikrobiota blandt kuld og reducere stress, når dyrene blev flyttet til den eksperimenterende miljø. Microbiome blev overført fra dam10. Mikrobiel diversitet til kolonien blev, hunner købt fra Jackson Labs og integreret i kolonien til en måned før eksperimentet startede9,10,12. At yderligere normalisere microbiome biodiversitet mellem dyr, var kvinder Co opstaldet tidligere hen til opdragelse. Efter avl, kommunale boliger under opdræt og evnen til at undslippe forbedret sygepleje pups stressniveau maternel pleje13,14, eventuelt fremme microbiome normalisering. For at forhindre ikke-EE relaterede effekter på microbiome, dette kommunale boliger af alle forsøgsdyr forhindret kampene og yderligere stress, der opstod, da kombinere flere mænd fra forskellige kuld i en eksperimentel bur. Endelig indgik lig antallet af dyr af alle genotyper i bure. Dette gav mulighed for forbedrede mikrobiota biodiversitet på tværs af genotyper, og fjernet bidrag af men (dyrets tendens til at forbruge afføring) eller muligt genotype-specifikke adfærdsmæssige forskelle til den samlede undersøgelse.
Denne protokol giver en strategi, der udvider tidligere EE undersøgelser til at omfatte kendte aspekter af microbiome forskning, herunder mikrobiota transmission og dyr koloni integration for mikrobiota normalisering, aktivere mere ensartet microbiome populationer mellem forsøgsdyr. Give agt på disse forholdsregler er afgørende på grund af ikke-behandling relaterede mikrobiota forskelle evne til at forvirre undersøgelsesresultater. At fjerne ikke-EE-relaterede mikrobiota ændringer vil sætte forskerne specifikt definere EE rolle på mikrobiota sammensætning under sygdomsudvikling og progression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne procedure giver mulighed for analyse af mikrobiota isoleret fra afføring efter miljøberigelse normal eller tumor forsynet med dyr. Fordi disse er store eksperimenter, der involverer avl for at få mange dyr af forskelligt køn og genotyper, normalisere microbiome mellem dyr før påbegyndelsen af eksperimentet er vigtigt at undgå ikke-EE relaterede effekter på microbiome biodiversitet.
For sammenhængen mellem NE og EE betingelser, er avls-processen gennemført for at sikre, at alle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker B. Dalley i University of Utah genomforskning kerne for biblioteket sekventering, og K. Boucher i University of Utah Biostatistik kerne for statistisk råd og adgang til disse tekniske kerner støttet af National Cancer Institute tildeling P30 CA042014. Projektet beskrevet blev støttet af National Cancer Institute tilskud P01 CA073992 og K01 CA128891 og jægeren Cancer Foundation.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
