एक विधि एक माउस बृहदांत्र ट्यूमर मॉडल में बृहदांत्र Microbiome जैव विविधता पर पर्यावरण संवर्धन के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए
Summary
पर्यावरण संवर्धन (EE) एक पशु आवास वातावरण है कि तंत्र है कि जीवन शैली, तनाव, और रोग के बीच कनेक्शन आबाद प्रकट किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रक्रिया है कि बृहदांत्र tumorigenesis और EE के एक माउस मॉडल का उपयोग करता है विशेष रूप से microbiota जैव विविधता में परिवर्तन है कि पशु मृत्यु दर को प्रभावित कर सकते है परिभाषित करते हैं ।
Abstract
हाल के कई अध्ययनों से मानव रोग में सुधार पर एक समृद्ध वातावरण में रहने के लाभकारी प्रभाव सचित्र है । चूहों में, पर्यावरण संवर्धन (EE) माउस प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के द्वारा tumorigenesis कम कर देता है, या ट्यूमर microenvironment में सुधार microbiome विविधता सहित घाव की मरम्मत प्रतिक्रिया, उत्तेजक द्वारा ट्यूमर असर पशु अस्तित्व को प्रभावित करता है । यहां प्रदान की एक विस्तृत प्रक्रिया के लिए एक माउस बृहदांत्र ट्यूमर मॉडल में microbiome की जैव विविधता पर पर्यावरण संवर्धन के प्रभाव का आकलन है । पशु प्रजनन और पशु जीनोटाइप और माउस कॉलोनी एकीकरण के लिए विचार के बारे में सावधानियों का वर्णन कर रहे हैं, जिनमें से सभी अंततः माइक्रोबियल जैव विविधता को प्रभावित । इन सावधानियों ध्यान अधिक वर्दी microbiome संचरण की अनुमति हो सकती है, और फलस्वरूप गैर उपचार निर्भर प्रभाव है कि अध्ययन निष्कर्षों को मिल सकता है कम हो जाएगा । इसके अलावा, इस प्रक्रिया में, microbiota परिवर्तन लंबी अवधि के पर्यावरण संवर्धन के बाद बाहर पेट से एकत्र मल से अलग डीएनए के 16S rDNA अनुक्रमण का उपयोग विशेषता है । आंत microbiota असंतुलन भड़काऊ आंत्र रोग और पेट के कैंसर के रोगजनन के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन यह भी मोटापे और मधुमेह के अंय लोगों के बीच । महत्वपूर्ण बात, EE और microbiome विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल को विभिंन रोगों की एक किस्म में microbiome रोगजनन की भूमिका का अध्ययन जहां मजबूत माउस मॉडल मौजूद है कि मानव रोग दोहराऊंगा कर सकते है का उपयोग किया जा सकता है ।
Introduction
पर्यावरण संवर्धन (EE) अध्ययन सामाजिक उत्तेजना (बड़े आवास पिंजरों, पशुओं के बड़े समूहों) को प्रभावित करने के लिए जटिल आवास मापदंडों का उपयोग, संज्ञानात्मक उत्तेजना (झोपड़ियों, सुरंगों, घोंसले में सामग्री, प्लेटफार्मों) और शारीरिक गतिविधि (चल रहा है पहियों) । EE कई प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया गया है वृद्धि की गतिविधि के प्रभाव को समझने के लिए और सुधार सामाजिक और रोग दीक्षा और प्रगति पर संज्ञानात्मक बातचीत माउस मॉडल की एक विस्तृत सरणी का उपयोग कर, प्रेरित खालित्य सहित नाई, अल्जाइमर रोग, Rett सिंड्रोम, और कई ट्यूमर और पाचन रोग मॉडल1,2,3,4,5,6।
कई माउस मॉडल चूहों में बृहदांत्र tumorigenesis अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । शायद सबसे अच्छी तरह से परिभाषित मॉडल Apcन्यूनतम माउस है । apcमिनट माउस १९९०7में विलियम कबूतर की प्रयोगशाला में विकसित किया गया था, और आमतौर पर मानव कोलोरेक्टल कैंसर के साथ जुड़े रहे हैं कि Apc जीन में उत्परिवर्तन के एक माउस मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. apc उत्परिवर्तनों बंदरगाह मानव के विपरीत, APCंयूनतम चूहों मुख्य रूप से छोटे आंत्र ट्यूमर का विकास, बृहदांत्र ट्यूमर के बहुत ही दुर्लभ घटना के साथ । हालांकि, Tcf4में एक एकल knockin नॉकआउट heterozygous उत्परिवर्तन के साथ एक Tcf4हेत एलील, काफी बृहदांत्र tumorigenesis बढ़ जाती है जब Apcमिनट एलील8के साथ संयुक्त । हाल ही में, बृहदांत्र tumorigenesis के इस माउस मॉडल के लिए बृहदांत्र tumorigenesis6पर EE के प्रभाव का निर्धारण किया गया है । Bice एट अलमें । अध्ययन, पुरुषों और चार अलग माउस लाइनों (वंय-प्रकार (WT) की महिलाओं पर EE के शारीरिक और phenotypic प्रभाव, Tcf4हेत/+ सुरक्ष+/+, Tcf4+/+ apcमिनट/ Tcf4 हेत ु/ Apcमिनट/) परिभाषित किया गया । शायद सबसे दिलचस्प लग रहा था कि EE काफी दोनों पुरुष और महिला बृहदांत्र ट्यूमर-असर जानवरों की उंर बढ़ जाती है । यह है कि EE कम से कम बृहदांत्र tumorigenesis के साथ जुड़े लक्षणों में से कुछ, और पशु स्वास्थ्य में सुधार कर सकते है प्रदर्शन किया । उल्लेखनीय है, पुरुषों में इस सुधार की उम्र कम tumorigenesis का प्रत्यक्ष परिणाम नहीं है, और इसके बजाय सुधार microbiome जैव विविधता6सहित एक ट्यूमर घाव हीलिंग प्रतिक्रिया की दीक्षा से जुड़ा हुआ था.
कई अपनाओ विशिष्ट अध्ययन रोचक परिणामों के साथ प्रकाशित किया गया है । तथापि, एक तकनीकी दृष्टिकोण से, महत्वपूर्ण परिणाम अक्सर अंय प्रयोगशालाओं के लिए अनुवाद नहीं कर रहे हैं । विभिंन प्रयोगशालाओं के बीच समान अपनाओ के तरीके को बनाए रखना एक अविश्वसनीय रूप से जटिल मुद्दा है, न केवल संवर्धन उपकरणों और आवास के कारण इस्तेमाल किया, लेकिन यह भी बिस्तर, भोजन, वेंटिलेशन, प्रजनन, आनुवंशिकी, कमरे में गतिविधि, और पशु प्रोटोकॉल आवश्यकताओं, दूसरों के बीच9,10,11। एक उदाहरण पशु एकता है, जहां जानवरों को चाकू से माउस कॉलोनी में एकीकृत किया जाना चाहिए, इसलिए आनुवंशिक पृष्ठभूमि और आहार संरचना सामांय, गैर से बचने के लिए उपचार से संबंधित प्रभाव । इसके अलावा, कई EE अध्ययन रोग में microbiome के महत्व की प्राप्ति से पहले पूरा कर लिया गया है, और जिस तरह से है कि आम माउस पशुपालन प्रथाओं आंत microbiome10,12की संरचना को प्रभावित कर सकते हैं ।
प्रजनन रणनीति और पशु नियुक्ति अपनाओ में अगर ठीक से प्रदर्शन नहीं किया तो तनाव बढ़ सकता है । के बाद से EE अध्ययन दोनों पुरुष और महिला जानवरों और कई पादी की बड़ी संख्या का उपयोग, प्रयोगात्मक सेटअप मुश्किल हो सकता है कई कूड़े से पशुओं के लिए संयुक्त किया जा आवश्यकता दी । इसलिए, एक प्रजनन और प्रातः रणनीति अलग कूड़े से सही जीनोटाइप के प्रातः पशुओं के संयोजन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था । इस के लिए प्राथमिक औचित्य को कूड़े के बीच microbiota सामांय और तनाव को कम करने के लिए जब पशुओं प्रयोगात्मक वातावरण में ले जाया गया था । microbiome को बांध10से प्रेषित किया गया । कालोनी के लिए माइक्रोबियल विविधता प्रदान करने के लिए, महिलाओं जैक्सन लैब्स से खरीदे गए थे और एक महीने के लिए कॉलोनी में एकीकृत प्रयोग से पहले9,10,12शुरू किया । पशुओं के बीच microbiome जैव विविधता को और सामान्य करने के लिए, महिलाओं को प्रजनन से पहले सह-स्थित किया गया था । प्रजनन के बाद, सांप्रदायिक आवास पालन और नर्सिंग पिल्ले से बचने की क्षमता के दौरान मातृ देखभाल13,14के तनाव के स्तर में सुधार, संभवतः आगे microbiome सामांयीकरण । microbiome पर गैर-EE संबंधित प्रभाव को रोकने के लिए, सभी प्रायोगिक पशुओं के इस सांप्रदायिक आवास से लड़ने और अतिरिक्त तनाव है कि जब एक प्रयोगात्मक पिंजरे में विभिन्न कूड़े से कई पुरुषों के संयोजन हुआ रोका । अंत में, सभी पादी के पशुओं के बराबर संख्या पिंजरों में शामिल थे । यह पादी भर में सुधार microbiota जैव विविधता के लिए अवसर प्रदान की है, और coprophagia के योगदान को हटा दिया (पशुओं के मल का उपभोग करने की प्रवृत्ति) या संभव जीनोटाइप-समग्र अध्ययन के लिए विशिष्ट व्यवहार मतभेद।
यह प्रोटोकॉल एक ऐसी कार्यनीति प्रदान करता है जो microbiome अनुसंधान के ज्ञात पहलुओं को शामिल करने के लिए पिछले EE अध्ययनों को विस्तृत करती है, जिसमें microbiota सामांयीकरण के लिए microbiota ट्रांसमिशन और एनिमल कॉलोनी एकीकरण, अधिक समान microbiome आबादी सक्षम करना है प्रायोगिक पशुओं के बीच । इन सावधानियों ध्यान गैर की क्षमता के कारण आवश्यक है उपचार संबंधित microbiota मतभेदों को पाया अध्ययन निष्कर्षों के लिए । गैर-ee संबंधित microbiota परिवर्तन को दूर करने के शोधकर्ताओं विशेष रूप से रोग के विकास और प्रगति के दौरान microbiota संरचना पर अपनाओ की भूमिका को परिभाषित करने के लिए सक्षम हो जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रक्रिया सामांय या ट्यूमर असर जानवरों के पर्यावरण संवर्धन के बाद मल से अलग microbiota के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । क्योंकि इन बड़े प्रयोगों जो विभिंन लिंगों और पादी के कई जानवरों को प्राप्त करने के…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पुस्तकालय अनुक्रमण के लिए यूटा जीनोमिक्स कोर के विश्वविद्यालय में बी डैले धन्यवाद, और सांख्यिकीय सलाह के लिए यूटा के विश्वविद्यालय जैव सांख्यिकी कोर में K. बाउचर, और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान पुरस्कार P30 CA042014 द्वारा समर्थित इन तकनीकी कोर के लिए उपयोग. वर्णित इस परियोजना को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान P01 CA073992 और K01 CA128891 और व्याध कैंसर फाउंडेशन ने समर्थन दिया था.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
