マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法
Summary
環境エンリッチメント (EE) は、ライフ スタイル、ストレスと病気間の接続の根底にあるメカニズムを明らかにするために使用される動物の住宅環境です。このプロトコルでは、動物の死亡に影響を与える可能性があります細菌の生物多様性の変化を定義する大腸腫瘍と EE のマウス モデルを使用する手順について説明します。
Abstract
いくつかの最近の研究は、人間の病気の改善に豊かな環境での生活の有益な効果を説明しています。マウスにおける環境エンリッチメント (EE) がマウスの免疫システムを活性化腫瘍を低減または腫瘍微小環境における改善マイクロバイ多様性を含む創傷修復応答を刺激することによって腫瘍軸受け動物の生存に影響を与えます。ここではマウスの大腸腫瘍モデルにおけるマイクロバイの生物多様性に関する環境エンリッチメントの効果を評価するための詳細な手順。動物飼育と動物の遺伝子型とマウス コロニー統合に関する考慮事項に関する注意事項、説明、すべての最終的に微生物生物多様性に影響を与えます。これらの注意事項を聞き入れより多くの均一マイクロバイ転送を許可することがあります、その結果調査の調査結果を混同することができます治療非依存の影響を軽減するため。さらに、この手順では、次の長期的な環境エンリッチメント遠位結腸から収集した便から分離された DNA の 16S rDNA 配列を使用してが微生物叢変化によって特徴付けられます。腸内細菌叢の不均衡は、炎症性腸疾患、大腸癌も肥満や糖尿病などの発症に関連付けられます。重要なは、さまざまな人間の病気を再現することができますマウスの堅牢なモデルが存在する疾患マイクロバイ病因の役割を研究する EE ・ マイクロバイ分析このプロトコルを利用できます。
Introduction
環境エンリッチメント (EE) 研究活用集合住宅社会的刺激 (大きい住宅ケージ、動物のより大きいグループ)、認知刺激 (小屋、トンネル、ネスト材料、プラットフォーム)、(実行中の身体活動に影響を与えるパラメーター車輪)。EE は、病気の開始そして進行の散髪誘導性脱毛症、アルツハイマー病を含むマウス モデルの広い配列を使用に及ぼす活動の増加と改善された社会と認知の相互作用を理解する多くの研究所で利用されていますレット症候群といくつかの腫瘍と消化器の病気は、1,2,3,4,5,6をモデル化します。
いくつかのマウス モデルはマウスの大腸癌の研究に開発されています。おそらく明確に定義されたモデルは、 Apc分マウスです。Apc分マウス 1990年7、ウィリアム ・鳩の研究所で開発された、ひと大腸癌に通常関連付けられているAPC遺伝子の変異マウスのモデルとして使用されています。APC遺伝子変異人間と対照をなしてApc分マウスは主に大腸腫瘍の非常にまれな出来事と小腸腫瘍を開発します。ただし、単一ノッキン ノックアウトTcf4、ヘテロ接合体変異Tcf4ヘット対立遺伝子は大幅にApc分対立遺伝子8と組み合わせれば大腸腫瘍を増加します。最近、大腸腫瘍のこのマウス モデルは大腸腫瘍6EE の効果を決定するために使用されています。Biceら。研究、4 つの異なるマウスの行の男女に EE の生理・表現型効果 (野生型(WT) Tcf4ヘット/+ Apc+/+、Tcf4+/+ Apc分/+、とTcf4Het/+Apc分/+)) に定義されました。おそらく最も興味深い発見だった EE が両方の男性と女性の大腸腫瘍動物の寿命を大幅に向上します。これは EE が少なくとも減らすことができること示されて症状の一部は大腸癌に関連付けられているし、動物の健康を改善します。驚くことに、男性のこの改良された寿命減らされた腫瘍の直接の結果ではない、代わりに腫瘍の治癒改善マイクロバイ生物多様性6を含む応答の開始にリンクされていた。
いくつかの EE 特定研究は興味深い結果で公開されています。ただし、技術的な観点からには、重要な結果を多くの場合他の所に変換可能です。濃縮デバイスと使用すると、住宅だけではなく、非常に複雑な問題が、また寝具、食品、換気、繁殖、遺伝学、活動ルーム、動物のプロトコルでは、異なる研究室間の同一の EE 方法論を維持します。他の中の要件9,10,11。1 つの例は動物の統合場所動物必要があります安定統合マウスのコロニーにしたがって非治療関連効果を避けるために、遺伝的背景と食事組成を正規化します。さらに、多くの EE 研究疾患と共通のマウス飼育慣行が腸内マイクロバイ10,12の組成に影響を与えることができる方法でマイクロバイの重要性を実現する前に完了しています。
EE の繁殖戦略や動物の配置正しく実行がいない場合、ストレスを増やすことができます。EE 研究利用する多数のオスおよびメス動物および複数の遺伝子型が、実験のセットアップできますので難しい結合するいくつかのリットルから動物の要件を考えます。したがって、繁殖と離乳戦略は異なるリットルから正しい遺伝子型の離乳の動物の組み合わせを許可するように開発されました。この主な根拠はリットルの間で細菌叢を正常化して動物に実験環境に移動されたときに、ストレスを軽減します。マイクロバイはダム10から送信されました。植民地に微生物の多様性を提供するために女性がジャクソン研究所から購入し、1 ヶ月前に実験が始まった9,10,12コロニーに統合します。マイクロバイ生物多様性動物との間をさらに正常化するには、女性が共同繁殖前に収容されました。次の繁殖、飼育中に共同住宅、脱出する能力は、看護の仔は、妊産婦ケア13,14、おそらくマイクロバイ正規化を促進ストレス レベルを向上しました。非 EE を防ぐために関連、マイクロバイに及ぼす影響は、すべての実験動物のこの共同住宅 1 つ実験ケージに異なるリットルからいくつかの男性を結合するときに発生した戦闘と追加のストレスを防止しました。最後に、すべての遺伝子型の動物の等しい数は、ケージの中で含まれていた。これは遺伝子の全体改善微生物叢の多様性のための機会を提供、coprophagia (便を消費する動物の傾向) または全体的な研究.に可能な遺伝子型固有の動作の違いの貢献を削除
このプロトコルはマイクロバイ研究所叢正規化、もっと制服マイクロバイ集団を有効にする微生物叢伝送と動物コロニーの統合を含む知られている側面を含める前の EE 研究を拡大する戦略を提供します。実験動物の間これらの注意事項を聞き入れは調査の調査結果を混同する非治療関連微生物叢の違いの能力が不可欠です。EE 以外を排除する関連微生物叢変化には発病と進行中の微生物叢組成に EE の役割を定義する研究者ができるようになります。
Protocol
機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ユタの大学によって承認されたプロトコルに従ってここで説明するすべての方法を行った。 1. 実験的なデザインと EE コントロール ケージ セットアップ 注:リファレンスについては、実験的なデザインの概要が示されています (図 1)。 コントロール (NE) と EE ケー?…
Representative Results
いくつかの研究は、心身医学の実践は、健康上の成果を向上させることを実証しています。同様に、マウスの環境エンリッチメント向上寿命と腫瘍傷修理6などを含む成果が向上します。そこで、EE プロシージャは、最初の実験 (図 1) の開始前にマイクロバイ標準化中この表現型の微生物叢の役割を定義する目的で開発されまし…
Discussion
この手順は、正常または担癌動物の環境エンリッチメントの次の便から分離された細菌叢の解析できます。これらは男女別と遺伝子型の多くの動物を取得する繁殖を含む大規模な実験なので実験の開始前に動物の間マイクロバイを正規化欠かせません非 EE を避けるために関連のマイクロバイに及ぼす影響生物多様性。
NE と EE の条件間の一貫性を保つのため、繁殖の過程…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はユタ大学の生物統計学コア統計アドバイスや国立がん研究所賞 P30 CA042014 でサポートされているこれらの技術のコアへのアクセスのためのライブラリの順序、および k. ブーシェのユタ大学ゲノム コア B. Dalley をありがとうございます。記載されたプロジェクトは、国立癌研究所助成金 P01 CA073992 K01 CA128891 とハンツマン癌財団によって支えられました。
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
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Cite This Article
Fuller, A. K., Bice, B. D., Venancio, A. R., Crowley, O. M., Staab, A. M., Georges, S. J., Hidalgo, J. R., Warncke, A. V., Angus-Hill, M. L. A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model. J. Vis. Exp. (132), e57182, doi:10.3791/57182 (2018).