Метод для определения последствий экологических обогащения на биоразнообразие Микрофлора толстой кишки в мышиной модели опухоли толстой кишки
Summary
Экологические обогащения (EE) является средой стойлового содержания, используемый для выявления механизмов, которые лежат в основе связи между образ жизни, стресс и болезни. Этот протокол описывает процедуру, которая использует модель мыши опухолей толстой кишки и EE конкретно определить изменения в микробиоты биоразнообразия, которые могут повлиять на животных смертности.
Abstract
Несколько недавних исследований показали благотворное влияние жизни в среде обогащается на улучшении болезней человека. В мышей экологическая обогащению (EE) уменьшает tumorigenesis, активации иммунной системы мыши или влияет на выживаемость животных подшипник опухоли, стимулируя рану ремонт реагирования, включая улучшение микрофлора разнообразия, в микроокружения опухоли. Условии Вот подробные процедуры для оценки воздействия экологических обогащения на биоразнообразие микрофлора в мышиной модели опухоли толстой кишки. Описаны меры предосторожности относительно разведения сельскохозяйственных животных и соображения для животных генотип и мыши интеграции колонии, все из которых в конечном итоге влияет на микробного разнообразия. Слушая эти меры предосторожности могут позволить более равномерное микрофлора передачи и следовательно снимет-лечение зависит от эффектов, которые можно смешивать выводы исследования. Кроме того в этой процедуре, Микробиота изменения характеризуются использованием 16S рДНК секвенирования ДНК, изолированных от стула, собранных от дистальной двоеточие после долгосрочных экологических обогащения. Кишка микробиоты дисбаланс ассоциируется с патогенезе воспалительных кишечника болезни и рака толстой кишки, но и ожирения и диабета среди других. Важно отметить, что этот протокол для EE и микрофлора анализа могут быть использованы для изучения роли микрофлора патогенеза различных заболеваний, где существуют надежные мыши модели, которые можно резюмировать болезней человека.
Introduction
Экологическая обогащению (EE) исследования используют сложные жилья параметры влияют на социальные стимуляции (клетки большой корпус, больших групп животных), когнитивной стимуляции (хижины, туннелей, раскроя материалов, платформ) и физической активности (работает колеса). EE был использован много лабораторий, чтобы понять воздействие повышенной активности и улучшение социального и когнитивные взаимодействия на начало заболевания и прогрессии, используя широкий спектр моделей мыши, в том числе Парикмахерские искусственный алопеция, болезнь Альцгеймера, Синдром Ретта и несколько опухоли и пищеварительных болезней модели1,2,3,4,5,6.
Были разработаны несколько мышь модели для изучения опухолей толстой кишки у мышей. Возможно наиболее четко модель является мышь Apcмин . Apcмин мышь была разработана в лаборатории William голубя в 1990 году7и был использован как модель мыши мутаций в гене APC , которые обычно связаны с человеческой колоректального рака. В отличие от людей, укрывательство APC мутации, мышей Apcмин прежде всего Разработайте небольшие опухоли кишечника, с очень редко опухолей толстой кишки. Однако Tcf4Het аллелей с одной knockin нокаут гетерозиготных мутации в Tcf4, значительно увеличивает опухолей толстой кишки при сочетании с Apcмин аллеля8. Недавно эта модель мыши опухолей толстой кишки был использован для определения воздействия EE на толстой кишки tumorigenesis6. В Bice и др. исследования, физиологические и фенотипические эффекты EE на мужчин и женщин в четырех различных мыши линий (одичал тип (WT), Tcf4Het / + Apc+/ +, Tcf4+/ + Apcмин / +, и Tcf4 Het / + APCмин / +)) были определены. Возможно наиболее интересно было что EE значительно увеличивает продолжительность жизни как мужчин, так и женщин толстой кишки опухоль подшипник животных. Это свидетельствует, что EE может уменьшить по крайней мере некоторые из симптомов, связанных с опухолей толстой кишки и улучшения здоровья животных. Удивительно это улучшение жизни мужчин не является прямым результатом сокращения tumorigenesis и вместо этого был связан с начала опухоль ранозаживляющее ответ, в том числе улучшение микрофлора биоразнообразия6.
Несколько EE конкретные исследования были опубликованы с интересные результаты. Однако с технической точки зрения, важные результаты часто не могут быть переведены в другие лаборатории. Поддержание идентичные EE методологий между различными лабораториями является невероятно сложный вопрос, не только за счет обогащения устройства и жилищного строительства используется, но также постельные принадлежности, еда, вентиляция, селекции, генетики, активность в комнате и животных протокол требования, среди прочих9,10,11. Одним из примеров является животных интеграции, где животные должны быть стабильно интегрированы в колонии мыши, поэтому нормализация генетический состав фона и диеты, чтобы избежать-лечение соответствующих эффектов. Кроме того, многие EE исследования были завершены до реализации важности микрофлора в болезни и то, что общие практики животноводства мыши может влиять на состав10,микрофлора кишечника12.
Размещения стратегии и животных селекции в EE может увеличить стресс, если не выполняется должным образом. Поскольку исследования EE использовать большое количество как мужские и женские животных, так и несколько генотипов, экспериментальная установка может быть трудно учитывая требование для животных из нескольких пометов сочетаться. Таким образом селекции и отлучение стратегия была разработана для объединения отлученных животных правильным генотипа из разных пометов. Главным обоснованием для этого было нормализовать микрофлору среди пометов и уменьшить стресс, когда животные были перемещены в экспериментальной среде. Микрофлора была передана от плотины10. Предоставлять микробного разнообразия в колонию, женщины были приобретены у Джексона Labs и интегрированы в колонии на один месяц, прежде чем начался эксперимент9,10,12. Для дальнейшей нормализации микрофлора биоразнообразия между животными, женщины были совместно размещены до размножения. После разведения, коммунальных квартирах во время воспитания и возможность избежать щенков кормящих улучшить уровень стресса матери13,14, возможно содействия нормализации микрофлора. Для предотвращения не EE воздействия на микрофлора, этот коммунальных квартирах всех подопытных животных помешала боевых и дополнительных стресс, возникающая при объединении несколько мужчин из разных пометов в один экспериментальный клетку. Наконец равное количество животных всех генотипов были включены в клетках. Это предоставило возможность для улучшения микробиоты разнообразия различных генотипов и удалены вклад копрофагия (животного тенденцию потреблять табуретки) или возможные различия в поведении генотип конкретных к изучению общей.
Этот протокол предусматривает стратегию, которая расширяет предыдущие исследования EE включить известных аспектов микрофлора исследований, включая микрофлору передачи и животных колонии интеграции для нормализации микробиоты, чтобы включить более равномерное микрофлора населения между подопытных животных. Слушая эти меры предосторожности важно из-за различия-лечение связанных микробиоты способность смешивать выводы исследования. Устранение не EE связанные изменения микробиоты позволит исследователям конкретно определить роль EE на микробиоту композиции во время развития болезни и прогрессии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта процедура позволяет для анализа микробиоты, изолированных от стула после экологическая обогащению нормальный или опухоли, принимая животных. Потому что эти большие экспериментов, которые включают размножения для получения многих животных разных полов и генотипов, нормализующее ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим B. Далли в ядре Университет Юты геномика для библиотеки виртуализации и K. Буше в ядре биостатистики университета Юты статистический совет, и доступ к эти технические ядер, поддержке Национального института рака премии Р30 CA042014. Описанный проект была поддержана национальной CA073992 P01 гранты института рака и K01 CA128891 и Фонд рака егерь.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
