En metode for å definere effekten av miljømessig berikelse på kolon Microbiome biologisk mangfold i en mus kolon svulst modell

Summary

Miljømessig berikelse (EE) er et dyr bolig miljø som brukes til å avsløre mekanismer underlie forbindelsene mellom livsstil, stress og sykdom. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte som bruker en musemodell av kolon tumorigenesis og EE spesielt definere endringer i bakterieflora biologisk mangfold som kan påvirke dyr dødelighet.

Abstract

Flere studier har vist de gunstige effektene av å bo i en berike omgivelsene på å forbedre menneskelig sykdom. I mus, miljømessig berikelse (EE) reduserer tumorigenesis av immunsystemet musen eller påvirker svulst bærende dyr overlevelse ved å stimulere såret reparasjon svaret, inkludert forbedret microbiome mangfold i svulst microenvironment. Gis her en detaljert prosedyre for å vurdere effekten av miljømessig berikelse på biologisk mangfold av microbiome i en mus kolon svulst modell. Forholdsregler angående avl og hensyn for dyr genotype og mus kolonien integrering er beskrevet, som til slutt påvirke mikrobiell biologisk mangfold. Akte disse forholdsregler kan gi en mer ensartet microbiome overføring, og derfor vil lindre behandling avhengige effekter som kan forvirre studere resultatene. Videre i denne prosedyren er bakterieflora endringer preget med 16S rDNA sekvenser av DNA isolert fra avføring fra distale kolonet langsiktige miljømessig berikelse. Gut microbiota ubalanse er forbundet med patogenesen av inflammatorisk tarm sykdom og tykktarm kreft, men også av fedme og diabetes blant andre. Viktigere, kan denne protokollen for EE og microbiome analyse benyttes for å studere rollen til microbiome patogenesen på tvers av en rekke sykdommer der robust musen modeller finnes som kan recapitulate menneskelig sykdom.

Introduction

Miljømessig berikelse (EE) studier utnytte komplekse bolig parametere for å påvirke sosiale stimulering (store bolig bur, større grupper av dyr), kognitiv stimulering (hytter, tunneler, hekkende materialer, plattformer) og fysisk aktivitet (kjører hjul). EE blitt benyttet av mange laboratorier å forstå effekten av økt aktivitet og forbedret sosiale og kognitive interaksjoner på sykdom initiering og progresjon med et bredt utvalg av musen modeller, inkludert barbering indusert alopesi, Alzheimers sykdom, Retts syndrom og flere svulst og fordøyelsesenzymer sykdom modeller^1,,^2,,^3,,^4,,^5,,⁶.

Flere musen modeller er utviklet for å studere kolon tumorigenesis i mus. Kanskje er den mest veldefinerte modellen Apc^Min musen. Apc^Min musen ble utviklet i laboratoriet av William Dove i 1990⁷, og har blitt brukt som en musemodell av mutasjoner i genet APC forbindes med menneskelige tykktarmskreft. I motsetning til Human skjuler APC mutasjoner, utvikle Apc^Min mus primært små intestinal svulster, med svært sjelden forekomst av kolon svulster. En Tcf4^Het allelet med en enkelt knockin knockout heterozygote mutasjon i Tcf4, øker imidlertid langt kolon tumorigenesis kombinert med Apc^Min allelet⁸. Nylig har denne musemodell kolon tumorigenesis blitt brukt til å bestemme effekten av EE på kolon tumorigenesis⁶. I Bice et al. studere, fysiologiske og fenotypiske effekten av EE på menn og kvinner av fire forskjellige mus linjene (vill-type (WT), Tcf4^{Het / +} Apc^{+/ +}, Tcf4^{+/ +} Apc^{Min / +}, og Tcf4 ^{Het / +} APC^{Min / +})) ble definert. Kanskje var mest interessante funn at EE øker levetiden til både mannlige og kvinnelige kolon svulst-bærende dyr. Dette viste at EE kan redusere minst noen av symptomene forbundet med kolon tumorigenesis og forbedre dyrehelse. Bemerkelsesverdig, denne forbedret levetid i menn er ikke et direkte resultat av redusert tumorigenesis, og stedet var knyttet til oppstart av en svulst sårheling svaret, inkludert forbedret microbiome biodiversitet⁶.

Flere EE spesifikke studier blitt publisert med interessante resultater. Men fra et teknisk synspunkt er viktige resultater ofte ikke oversettbare til andre laboratorier. Opprettholde samme EE metoder mellom forskjellige laboratorier er en utrolig komplekse problemet, skyldes berikelse enheter og bolig brukes, men også sengetøy, mat, ventilasjon, avl, genetikk, aktivitet i rommet og animalsk-protokollen krav, blant annet^9,10,11. Et eksempel er dyr integrasjon, hvor dyr må stabilt integreres i musen kolonien, derfor normalisere genetisk bakgrunn og kosthold komposisjon, for å unngå behandling relaterte effekter. Videre, mange EE studier er fullført før realisering av betydningen av microbiome i sykdom, og måten at felles musen dyrehold praksis kan påvirke sammensetningen av tarmen microbiome^10,12.

Avl strategi og dyr plassering i EE kan øke stress hvis ikke utføres riktig. Siden EE studier bruker store mengder både mannlige og kvinnelige dyr og flere genotyper, kan eksperimentelle oppsett være vanskelig gitt behovet for dyr fra flere søppel kan kombineres. Derfor utviklet en avl og avvenning strategi for å tillate kombinere Avvent dyr av riktig genotype fra ulike søppel. Primære begrunnelsen for dette var å normalisere bakterieflora blant søppel og redusere stress når dyr ble flyttet til eksperimentelle miljøet. Microbiome ble overført fra demningen¹⁰. For å gi mikrobiell mangfold å kolonien, ble kvinner kjøpt fra Jackson Labs og integrert i kolonien i en måned før forsøket begynte^9,10,12. Å fremme normalisere microbiome biologisk mangfold mellom dyr, var kvinner co ligger tidligere å formering. Etter avl, felles bolig i oppdrett og muligheten til å unnslippe forbedret sykepleie pups stress nivåer av mors omsorg^13,14, muligens fremme microbiome normalisering. For å hindre ikke-EE relaterte effekter på microbiome, denne felles bolig av alle forsøksdyr forhindret kampene og ekstra stress som oppstod ved kombinere flere menn fra forskjellige kull i en eksperimentell bur. Til slutt, lik antall dyr av alle genotyper ble inkludert i merdene. Dette gitt muligheten for forbedret bakterieflora biodiversitet over genotyper og fjernet bidrag av coprophagia (dyrets tendens til å konsumere avføring) eller mulig genotype-spesifikke atferdsdata forskjeller til generelle studiet.

Denne protokollen gir en strategi som utvider tidligere EE studier med kjente sider ved microbiome forskning, inkludert bakterieflora overføring og dyr kolonien integrasjon for bakterieflora normalisering, aktivere mer ensartet microbiome bestander mellom forsøksdyr. Akte disse forholdsreglene er viktig på grunn av muligheten for behandling relaterte bakterieflora forskjeller å forvirre studere resultatene. Fjerne ikke-EE relatert bakterieflora endringer vil aktivere forskere spesielt definere rollen EE på bakterieflora komposisjon under sykdom utvikling og progresjon.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble utført i henhold til protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Utah. 1. eksperimentell Design og EE og bur oppsett Merk: For referanse, en disposisjon av eksperimentell design er illustrert (figur 1). Definerer kontroll (NE) og EE bur (figur 2). <l…

Representative Results

Flere studier har vist at praktiseringen av sinn-kropp medisin bedre helseutfall. Tilsvarende i mus forbedrer miljømessig berikelse resultater inkludert forbedret levetid og svulst sår reparasjon6. Derfor utviklet en EE fremgangsmåte for definering av rollen for bakterieflora i denne fenotypen mens første normalisere microbiome før oppstart av eksperimentet (figur 1). Viktigere, alle avlsdyr er integrert i musen kolonien i minst e…

Discussion

Denne prosedyren kan for analyse av bakterieflora isolert fra avføring etter miljømessig berikelse av normal eller svulst bærende dyr. Fordi disse er store eksperimenter som involverer avl for å få mange dyr av ulike kjønn og genotyper, normalisere microbiome mellom dyr før begynnelsen av eksperimentet er viktig å unngå ikke-EE relaterte effekter på microbiome biologisk mangfold.

For konsistens mellom NE og EE, er oppdrett prosessen gjennomført for å sikre at alle mus først har ek…

Materials

Teklad Diets/Harlan Labs Chow	Harlan Labs	3980X	Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs.
Cell-Sorb Plus bedding	Fangman Specialties	82010	Autoclave prior to use.
AIMS Tattooing System For Neonates	AIMS	NEO-9	https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system	Lab Products	82120ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device	Lab Products	82109ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth	Lab Products	82100ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top	Lab Products	82101ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Tunnel	Bio-Serv	K3323 or K3332	Connect cages together and use for enrichment
Grommet to connect Tunnel to cages	Fabricated by the University of Utah Machine Shop	n/a	Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable
Fast-track wheel	Bio-Serv	K3250 or K3251	Use with mouse igloo and floor
Mouse Igloo	Bio-Serv	K3328, K3570 or K3327	Use with Fast-track wheel and floor
Mouse Igloo floor	Bio-Serv	K3244	Use with mouse Igloo and Fast-Track
Mouse Hut	Bio-Serv	K3272, K3102 or K3271
Crawl Ball	Bio-Serv	K3330 or K3329
Bio-hut	Bio-Serv	K3352	Wood pulp hut used for sheltering and nesting
Adhesive film	VWR	60941-072	Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping
Laminar Flow Ventilated Rack	Techniplast	Bio-C36	The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar.
1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free	Any supplier
QIAamp DNA Stool MiniKit	Qiagen	51504	This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE
Waterbath (capable of heating to 95)	Any supplier		For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells.
Waterbath (capable of heating to 70 degrees)	Any supplier		For 70 degree incubation of stool samples
Ethanol (200 proof)	Sigma Aldrich	E7023
Fluorometer: Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33216
Qubit dsDNA broad Range Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32850
EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5	Qiagen	19086
Experiment specific primers	Any Supplier
PCR grade water	Any supplier
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix	Kapa Biosystems	KK2601	For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns).
Agarose for running diagnostic gels	Any supplier
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace	Agilent	5067-5583	TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used.
Agencourt AMPure XP Magnetic Beads	Beckman Coulter	A63880	Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions
Magnetic stand	Life Technologies	AM10027
Library Preparation Guide	Illumina		Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Unique Dual Indexing	Illumina	Illumina Experiment Manager Software	Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index Kit	Illumina	FC-131-1002	Used to add barcodes to amplicons
MicroAmp Optical 96-well reaction plate	Applied Biosystems/ThermoFisher	N8010560
TruSeq Index Plate Fixture	Illumina	FC-130-1005
Adhesive clear plate seal	Applied Biosystems /ThermoFisher	4360954	Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film
Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads	Illumina	MS-102-3003
PhiX Control Kit	Illumina	FC-110-3001
Proteinase K (600 mAU/ml)	Qiagen	19131	Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit
Data Analysis Tools	Qiime	QIIME software Tools	Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Step 13.2.	Qiime	FastQ Join method	(http://code.google.com/p/ea-utils  ).  For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011).
Step 13.3.	Qiime	De-Novo OTU picking protocol	http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Step 13.3.1.		Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust	Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Step 13.3.1.	Pynast	Pynast	Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010).
Step 13.3.1.	Pynast	Pynast_Greengenes	DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study
13.3.1. Note:	Qiime	Multiple Split Libraries	http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Note:	Qiime	Pick de novo OTUs script	http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html
Step 13.2.2.	Qiime	Create a mapping file	http://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Step 13.2.2.	Qiime	Validate a mapping file	http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Step 13.3.3.	Qiime	Link the OTU to sample description to mapping file	http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Step 13.3.4.	Qiime	Summarize Taxa through plots	http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Step 13.3.5.	Qiime	Biome Summarize table	http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME.