Summary
هنا، فإننا نقدم القياس الكمي غير منحازة للبروتين خاصة بالموقع شغل أسيتيليشن و/أو سوكسينيليشن (ستويتشيوميتري) للبروتين الكامل عن طريق تحليل راتيوميتريك الذاتية تعديلات على التعديلات التي أدخلت بعد الكمية أسيليشن الكيميائية استخدام مستقرة أو أملاحه المسماة النظائر. في تركيبة مع حيازة مستقلة عن البيانات الحساسة الكتلي، يتم الحصول على قياسات شغل الموقع دقيقة.
Abstract
الحث على تعديل بوستترانسلاشونال (PTM) من بقايا يسين البروتين من NƐ-أسيليشن التغييرات الهيكلية التي يمكن أن تنظم بشكل حيوي وظائف البروتين، على سبيل المثال، بتغيير النشاط الأنزيمي أو بوساطة التفاعلات. تحديد كمي دقيق لشغل أسيليشن البروتين الخاصة بالموقع، أو stoichiometry، أمر ضروري لفهم العواقب الوظيفية العالمية ذات المستوى المنخفض ستويتشيوميتري وستويتشيوميتري أسيليشن الرفيع المستوى الفردي ليسين محددة المخلفات. مجموعات أخرى قد أفادت قياس يسين acetylation stoichiometry بمقارنة نسبة نظائر السلائف الببتيد من أسيليشن الطبيعية الذاتية، ووفرة وعرض أسيليشن النظائر التي تحمل علامات خارجية، ثقيلة بعد الكمية أسيتيليشن الكيميائية للبروتينات باستخدام المسمى النظائر المستقرة أنهيدريد الخل. ويصف هذا البروتوكول نهج أمثل يضم العديد من التحسينات، بما في ذلك: (1) زيادة كفاءة أسيليشن الكيميائية، (2) القدرة على قياس البروتين سوكسينيليشن بالإضافة إلى أسيتيليشن، و (3) تحسين دقة الكمية المقرر أن انخفاض تداخلات استخدام جزء أيون الكمي من الحيازة مستقلة عن البيانات (DIA) بدلاً من إشارة أيون السلائف من اقتناء البيانات تعتمد على (DDA). استخدام المناطق ذروة المستخرجة من الأيونات جزء للتحديد الكمي أيضا فريد يتيح التفريق بين ستويتشيوميتري أسيليشن مستوى الموقع من الببتيدات بروتيوليتيك التي تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا يسين، التي ليس من الممكن استخدام السلائف أيون إشارات للقياس الكمي. التصور البيانات في أفق، بيئة البروتيوميات كمية مفتوحة مصدر، يسمح بالتفتيش ملاءمة البيانات واستعراضها. معا، يوفر سير العمل هذا التقدير الكمي غير متحيزة ودقيقة، ودقيقة لشغل البروتين الكامل، التي يمكن أن تكشف وإعطاء الأولوية للمواقع ذات الصلة بيولوجيا أسيلاتيون acetylation و succinylation يسين الخاصة بالموقع.
Introduction
NƐ-أسيليشن من بقايا يسين البروتين منظم هام لوظيفة البروتين. يسين acetylation وأسيليشنز الأخرى، مثل سوكسينيليشن، مالونيليشن، وجلوتاريليشن، ويعتقد أن تنظيم الأيض، مما يشير إلى خلية، وسائر العمليات الخلوية1،2،3،4 ، ولها آثار في الاضطرابات الأيضية5. وجدت العديد من الدراسات أن التعديلات اشيل يسين تغيرات كبيرة إضعاف-تحت ظروف مختلفة في أنسجة الثدييات وخلية خطوط5،6،،من78 ، وكذلك البكتيريا9،،من1011، ومع ذلك، هذه التغييرات النسبية إضعاف لا ثاقبة نسبة البروتين الكلي تعديل. تغيير الدراسات الإبلاغ عن قياسات لشغل موقع أسيليشن النادرة12،،من1314، على الرغم من الأهمية وحاجة لمثل هذه الدراسات أنها توفر المزيد من التفاصيل من حظيرة النسبي. على سبيل المثال، يمكن تغيير إذ تمثل زيادة شغل موقع من 0.01 إلى 0.1% 1 إلى 10% أو حتى 10 إلى 100%. قياسات دقيقة stoichiometry مطلوبة لتفسير أهمية بيولوجية أسيليشن والتنبؤ بالأثر فيما يتعلق بحجم البروتين الهيكلي، وربما تغييرات وظيفية.
يستخدم الأسلوب السابق واحد التحديد الكمي لشغل موقع الثقيلة النظائر المستقرة العلامات الكيميائية مخلفات يسين غير معدلة تليها الكتلي لقياس النسبة بين الذاتية acetylation "الخفيفة" بالمقارنة مع الخارجية، يسمى كيميائيا "الثقيلة" أسيتيل-يسين استخدام السلائف أيون كثافات12. آخر دراسة أجريت مؤخرا بزهو وآخرون. 13 وصف نهج مماثل لتقييم stoichiometry acetylation يسين أيضا يعمل أسيتيليشن كيميائية كاملة من جميع مخلفات يسين غير معدلة في البروتينات مع النظائر المستقرة التي وصفها، لكنها تستخدم كثافات أيون يفتت مقاسا أجندة الدوحة للتنمية. ناكاياسو وآخرون. 14 تستخدم نهجاً مماثلاً في أجندة الدوحة للتنمية، ولكن بدلاً من ذلك استخدام نسبة أيونات إيمونيوم الخفيفة والثقيلة أسيتيل-يسين للقياس الكمي. القياس الكمي استناداً إلى أيونات يفتت، أيونات إيمونيوم أو تسلسل (MS2)، في معظم الحالات نتج عن تداخلات إشارة أقل مقارنة بمعالجة سليمة الببتيد السلائف أيونات (MS1). ومع ذلك، التحديد الكمي لأيونات جزء من الأطياف MS/MS المولدة بأجندة الدوحة للتنمية يمكن يعانون من نقص أخذ العينات العشوائية، حيث الأيونات السلائف وفرة عالية من المرجح أن يتم اختيارها ل MS/MS، ويؤدي بالتالي، إلى عينة متحيزة وغير مكتملة من أيونات السلائف.
هذه رواية سير العمل4 (الشكل 1) يستخدم نظرياً نظائر مستقرة كيميائية وسم نهج وضعت أصلاً من قبل بايزا et al. 12، لكن سير العمل بعد ذلك يقترن ديا لجمع كل السلائف ووفرة أيون يفتت متعددة عبر وسائل الاكتشاف تتراوح15،16 توفير حسابات stoichiometry دقيقة.
مناطق الذروة من تجزئة الأيونات التي تحتوي على الموقع أسيليشن للفائدة، أو 'التفريق أيونات يفتت'، وتستخدم للتحديد الكمي لشغل موقع أسيليشن (الشكل 2). أيونات بلغة لا تحتوي على التعديل قيم متطابقة الخفيفة والثقيلة m/z، وتستخدم لتحديد الببتيد ولكن ليس للقياس الكمي. أفق البرمجيات17 يستخدم لاستخراج السلائف وجزء من مناطق الذروة. وجود أيونات يفتت متعددة تحتوي على موقع أسيليشن معين يوفر المرونة إذا تم الكشف عن التدخل في بعض الأيونات جزء. التصور البيانات في أفق يسمح للتفتيش الحرجة من نسب أيون يفتت الخفيفة إلى الثقيلة. بالإضافة إلى تحليل البيانات يدوياً، وضعت مجموعة R مفتوحة مصدر كتب داخليا، ستيوتشيوليزير (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR)،، الذي يستخدم السلائف أيون ويفتت أيون البيانات التي يتم جمعها عن طريق ديا ويوضحها أسيليشن الخاصة بالموقع ستويتشيوميتري من الببتيدات تحتوي على بقايا يسين متعددة، سمة غير ممكن مع السلائف كثافة أيون فقط القياسات4.
كما يوضح هذا البروتوكول استعمال اندوبروتيناسي غلو-ج، التي محددة للانقسام الطرفي ج في بقايا الجلوتاميك وحمض الأسبارتيك، بدلاً من استخدام التربسين أو مبطلات Arg-C، كما هذا الأخير غالباً ما تولد كبيرة جداً ويحتمل أن تتضاعف أسيلاتيد proteolytic الببتيدات الناتجة عن الانقسام التربسين المحظورة في المخلفات يسين أسيلاتيد. ومددت الكيميائية تسمية الإجراء أيضا تشمل استخدام succinic الخل (الشكل 1)، مما يمكن من التحديد الكمي سوكسينيليشن ستويتشيوميتري سوكسينيليشن. بالإضافة إلى التحسينات في إعداد عينة، تنفيذ تجزئة الببتيد بالاس الهيدروجيني دون اتصال، الأساسية، انخفض عكس-المرحلة (bRP) فصل من الببتيدات كذلك تداخلات الكمي، مما يتيح الالتواء دي أفضل من أسيليشن ستويتشيوميتري في عينات البروتين الكامل. معا، ويتميز هذا الأسلوب ويسلط الضوء على العديد من المزايا: (1) زيادة كفاءة أسيليشن الكيميائية؛ (2) قياس البروتين سوكسينيليشن ستويتشيوميتري بالإضافة إلى أسيتيليشن؛ و (3) التحديد الكمي تحسين الدقة. تحسين التقدير الكمي سبب انخفاض تداخلات في إشارات أيون جزء من ضياء مقارنة بإشارة السلائف أجندة الدوحة للتنمية، فضلا عن تنفيذ تجزئة دون اتصال الببتيد قبل برنامج إعادة هندسة العمليات.
Protocol
1-الكمية Acetylate و/أو بروتينات سوكسينيلاتي استخدام النظائر المسمى الخليك أو الخل سوكسينيك
- إعداد replicates 3 من 100 ميكروغرام من عينة بروتين ألبومين المصل البقري (BSA) بالتوازي، بتركيز 1 ميكروغرام/ميليلتر (ما مجموعة 100 ميليلتر)، باستخدام اليوريا وتريثيلامونيوم بيكربونات (برنامج) الحل (م 8 اليوريا، برنامج، درجة الحموضة 8 200 ملم).
ملاحظة: من المهم استخدام خالية من أمين المخزن المؤقت. بروتين العينات المستخدمة هنا في قسم النتائج ممثل جيش صرب البوسنة، كمياً سوكسينيلاتيد جيش صرب البوسنة، والخلائط العائد منها جيش صرب البوسنة عينات مع تعريف شغل سوكسينيليشن 0%، 1%، 10%، 50% ونسبة 100%، على التوالي (كل عينة وستعد في 3 replicates). هذا البروتوكول أيضا تم أداؤه باستخدام ليساتيس البروتين من الإشريكيّة القولونية والفأر الكبد4. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول إلى ليساتيس الخلايا أو الأنسجة الأخرى. - تخفيض 100 ميكروليتر من عينة جيش صرب البوسنة (100 ميكروغرام) مع 8 ميليلتر من ديثيوثريتول 250 ملم (DTT) للوصول إلى تركيز نهائي من 20 مم DTT واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الانفعالات 1,400 لفة في الدقيقة.
- الكيلات العينة جيش صرب البوسنة مخفضة مع 21.6 ميليلتر من إيودواسيتاميدي 200 ملم للوصول إلى تركيز نهائي من 40 مم إيودواسيتاميدي واحتضان العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: من المهم أن يكون تركيز إيودواسيتاميدي قليلاً أكثر من 2 x تركيز DTT لضمان أن كل خفض ثيولس البروتين هي يؤلكل. -
المضي قدما في إعداد أنهيدريد الخل-د6 (الخطوة 1.4.1) أو سوكسينيك الخل-د4 (الخطوة 1.4.2) اللازمة الكيميائية أسيتيليشن (الكمية) أو سوكسينيليشن من العينات.
- تحديد مولاريتي (M) من قاسمة ز 1د6 حل مائي أنهيدريد الخل-من الوزن الجزيئي (108.13 g/mol) والكثافة (1.143 g/mL عند 25 درجة مئوية).
ملاحظة: تتضمن الحزمة 1 ز µmol 9,248 أنهيدريد الخل-د6 في حجم ميليلتر 875، تسفر عن حل م 10.57 المستخدمة لكل أسيتيليشن العينات. - تحضير حل م 5 succinic الخل-د4 بتذويب المسحوق في [دمس] اللامائى فورا قبل رد فعل لتجنب التحلل الكاشف. حل ز 0.24 succinic الخل-د4 في ميليلتر 461 من اللامائى [دمس] للحصول على حل م 5.
- تحديد مولاريتي (M) من قاسمة ز 1د6 حل مائي أنهيدريد الخل-من الوزن الجزيئي (108.13 g/mol) والكثافة (1.143 g/mL عند 25 درجة مئوية).
- أداء acetylation الكيميائية الكمية أو سوكسينيلاتيون عن طريق إضافة µmol 60-أنهيدريد الخلد6 (6 ميليلتر من الحل م 10.57) أو سوكسينيك الخل-د4 (12 ميليلتر من الحل م 5) على التوالي، واحتضان عينة في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في خلاط دوامة.
ملاحظة: بسبب الحموضة أو أملاحه، قد يعجل البروتينات. تأخذ ملاحظة وضبط كما هو موضح في الخطوة 1، 6. - إضافة 10 ميليلتر من 7.25 م هيدروكسيد الصوديوم بعد الحضانة لزيادة درجة الحموضة ~ 8 إلى القضاء على أي المنتجات الجانبية س-أسيليشن. الدوامة بإيجاز والاختيار الهيدروجيني عينة باكتشاف 1 ميليلتر في ورقة الأس الهيدروجيني.
ملاحظة: قد يكون من الضروري إضافة أكثر من 10 ميليلتر من 7.25 هيدروكسيد الصوديوم M للوصول إلى درجة الحموضة 8. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إعادة حل البروتينات يحتمل أن تكون سرع. - كرر الخطوات التكيف كل أسيليشن والرقم الهيدروجيني 1.5 و 1.6 لما مجموعة ثلاث مرات. تحقق من قيم الأس الهيدروجيني وملاحظة حجم الحل الأساسي أضيف كل تكرار. العمل سريعاً من خلال ما ورد أعلاه الخطوات أسيليشن الكيميائية لأنه سوف يتحلل أو أملاحه وتفقد مفاعليه.
- بعد التعديل رد الفعل ودرجة الحموضة وضع العلامات النهائية، إضافة 10 ميليلتر من محلول 50% هيدروكسيلاميني العودة ردود فعل الجانب س-أسيليشن.
2-خلاصة ورد عينات البروتين باستخدام اندوبروتيناسي غلو-ج
- تخفيف تركيز اليوريا إلى 0.8 م باستخدام 50 مم برنامج، درجة الحموضة 8 وتطبيع حجم العينة.
- هضم العينات البروتين بإضافة اندوبروتيناسي غلو-ج في 01:50 مبطلات لنسبة البروتين الركازة (w/w) واحتضان العينات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع إثارة الشغب 1,400 لفة في الدقيقة.
- أسيديفي واخماد العينات هضم البروتين بإضافة حمض الفورميك إلى 1 في المائة من حيث الحجم.
-
تحلية العينات باستخدام ميزان ماء محبتين الصلبة-مرحلة استخراج خراطيش. استخدام كارتريدج مسيل 30 ملغ واحد كل المواد عينة، والحد الأقصى 5 ملغ كل خرطوشة4،18.
ملاحظة: من المهم إبقاء مسيل داخل خرطوشة الرطب طوال هذه العملية ديسالتينج. عند الضرورة، قم بإيقاف تشغيل مضخة فراغ لإبطاء مرور المذيبات أو عينة من خلال الخرطوشة.- إدراج كارتريدج المنفذ (المنافذ) على كتلة الزجاج 24 منفذاً فراغ المتشعبة وتشغيل مضخة فراغ. ترك المنفذ (المنافذ) غير مستخدمة وتوج. مغادرة ميناء واحد أو اثنين توج الأمم المتحدة للحفاظ على ضغط أقل على مقياس الفراغ إذا لزم الأمر.
- ويت كل خرطوشة مرتين مع 800 ميليلتر من 80% الاسيتو الانيتريل (ACN)/0.2% acid/19.8% الفورميك المياه. ضمان ما زال مستوى المذيبات 2 – 3 مم فوق مستوى ماصة. ضمان قياس الفراغ على المشعب يقرأ 16.9 – 67.7 كيلو باسكال (5 – 20 في Hg).
- توازن كل خرطوشة ثلاث مرات مع 800 ميليلتر من حمض الفورميك 0.2% في المياه. ضمان قياس الفراغ على المشعب يقرأ 16.9 – 67.7 كيلو باسكال (5 – 20 في Hg).
- تحميل عينات الببتيد إلى الخرطوشة. ضمان قياس الفراغ على المشعب يقرأ 6.77 – 8.47 كيلو باسكال (2-2.5 في زئبق)، ولا يتجاوز معدل التدفق 1 مل/دقيقة.
- تغسل كل خرطوشة ثلاث مرات مع 800 ميليلتر 0.2% حمض الفورميك في المياه. ضمان قياس الفراغ على المشعب يقرأ 16.9 – 67.7 كيلو باسكال (5 – 20 في Hg).
- إزالة الخرطوشة من فراغ المتشعبة ويستقرون في microtube 1.5 مل.
- الوت الببتيدات مرة واحدة مع 800 ميليلتر من الماء acid/19.8% الفورميك ACN/0.2% 80%، والسماح المذيبات لاحتضان مع مسيل لمدة 2 – 3 دقيقة.
- استخدام ماصة للمذيبات الدفع من خلال طبقة ماصة داخل الخرطوشة. كرر شطف الثاني 400 ميليلتر 80% ACN/0.2% acid/19.8% الفورميك المياه إلى microtube 1.5 مل نفسه.
- جاف النذرة بفراغ الطرد المركزي (الثابتة معدل الطرد المركزي في 268 س ز)، عادة ح 3.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، عينات النذرة المجففة يمكن تخزينها مجمدة في-20 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما في تجزئة.
3-يجزئ الببتيدات استخدام دون اتصال Basic-الأس الهيدروجيني عكس المرحلة [هبلك]
- إعادة تعليق كل أسيلاتيد وعينات غلو-ج هضمها (إعداد كما هو موضح في المقاطع 1 و 2) في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت A (10 ملم فورمات الأمونيوم في الماء، ودرجة الحموضة 10) وخلط العينة لمدة 10 دقيقة في خلاط دوامة عند 4 درجة مئوية، والطرد المركزي في س 17,500 ز لمدة 10 دقائق في غرفة الشركة المصرية للاتصالات مبيراتوري.
ملاحظة: العينة الببتيد الناتجة على استعداد لأن تكون حاليا مجزأ حسب درجة الحموضة العالية الفصل19،20. - البرنامج طريقة تجزئة دون اتصال [هبلك] حسب الصك والبرمجيات المستخدمة. الأسلوب التالي محددة لنظام ضخ ثنائي [هبلك] بما في ذلك كاشف ثنائي طول موجه الأشعة فوق البنفسجية وأوتوسامبلير، وجامع كسر وعمود C18 (4.6 ملم × 250 ملم، 5 ميكرون حجم الجسيمات) التي تتسامح مع الأس الهيدروجيني 10.
- جمع الكسور 40 كل ل 2.1 دقيقة لكل جزء، والجمع بين كل جزء الرابع، أسفر عن أربعة كسور التجميعي النهائي4. يمكن استخدام عدد أكبر من الكسور المجمعة لمواصلة الحد من تعقيد عينة على حساب وقت جمع البيانات الكتلي.
- الجاف للكسور المجمعة في ليوفيليزير وتعليق إعادة العينات المجففة الببتيد في 1 مل حمض الفورميك تزاول و 1% 50% في المياه، ونقلها إلى حاوية عينة أصغر. الجاف للعينة المنقولة عبر فراغ الطرد المركزي (الثابتة معدل الطرد المركزي في 268 س ز)، عادة ح 1.
ملاحظة: ضغط بخار منخفض فورمات الأمونيوم يمكن صعوبة تجفيف كاملة. إذا بقيت كميات كبيرة من ملح فورمات الأمونيوم ترسبات الملح بعد التجفيف، كرر استخراج المرحلة الصلبة. - إعادة تعليق العينات في 20 ميليلتر من حمض الفورميك 0.2% في المياه مع الاحتفاظ بفهرسة الوقت (iRT) الببتيد خليط القياسية.
ملاحظة: نماذج جاهزة الآن لتحليل الطيف الكتلي.
4-ديا تحليل العينات الببتيد هورمونات
-
تحليل العينات استخدام أسلوب ضياء LC-MS/MS، التي يمكن تعديلها وفقا للصكوك والمطيافيه الجماعية المتوفرة. تم إجراء التحليل باستخدام نظام [هبلك] نانو-LC 2D على الإنترنت متصلة بالرباعي متعامد وقت طيران (ققتوف) مطياف كتلة.
- برنامج البرمجيات الصك حتى أن خلائط الببتيد يتم نقلها على شريحة ما قبل عمود C18 (200 ميكرومتر × 6 مم C18-CL رقاقة، 3 ميكرومتر، 300) ويغسل في 2 ميليلتر في الدقيقة لمدة 10 دقيقة مع المذيب تحميل (حمض الفورميك O/0.1%2ح) الملحي.
- فصل الببتيدات تشروماتوجرافيكالي على شريحة سم C18-CL 75 ميكرون x 15 (3 ميكرومتر، 300) بمعدل 300 nL/دقيقة مع استخدام التدرج ح 2 نموذجية (والخاصة بنظام LC) تدفق مائي والمذيبات تزاول المخازن4.
- إنشاء أسلوب ضياء نافذة متغير، حيث يتم تمرير windows النطاق الشامل لعرض متغير (5 إلى 90 m/z) من الرباعي Q1 في الخلية الاصطدام بخطوات تدريجية عبر النطاق الكامل الشامل (m/z 400-1,250).
ملاحظة: وقت دورة 3.2 s يشمل تفحص أيون سلائف 250 ms تليها فترة تراكم 45 ms لكل من قطاعات رقعة 6421،22.
- تحديد الببتيدات استخدام إجراء تحليل مواز لعينات من مرض التصلب العصبي المتعدد أجندة الدوحة للتنمية وبناء المكتبات الطيفية، أو بدلاً من ذلك، يمكن تحديد الببتيدات مباشرة من البيانات ديا بيقيد البرنامج23، الذي يتعامل مع جميع الخطوات التقنية لتجهيز البيانات، باستخدام تحديد الهوية، والاستيراد إلى أفق للقياس الكمي اللاحقة.
5-مثال تعليمي تحليل البيانات
-
تحميل برنامج أفق (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) وقم بإنشاء حساب بانوراماويب (https://panoramaweb.org).
ملاحظة: لدروس مفصلة تصف استخدام أفق مع البيانات، الرجاء راجع (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). قد تستخدم خوارزميات برامج أخرى بدلاً من ذلك لاستخراج الشظايا الخفيفة والثقيلة أيون ذروة المناطق من عمليات الشراء ديا، مثل "رقعة مفتوحة"24، المساعد 2.0 رقعة إلى بيكفيو25و26من سبيكتروناوت.- تحميل ملف البيانات أفق لنتائج تمثيلية سوكسينيلاتيد جيش صرب البوسنة (الشكل 3) من "البانوراما العامة": https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. على صفحة ويب بانوراما، انتقل إلى جدول "تستهدف تشغيل MS"، وتحميل الملف sky.zip اختيار رابط التحميل على الجانب الأيمن. استخراج.zip تحميل المجلد وانقر نقراً مزدوجاً فوق الملف لفتحه في أفق skyline.sky. تحقق من الببتيد شظية أيون الهدف الشجرة (اللوحة اليمنى) وتشروماتوجرامس أربعة من نسب محددة من سوكسينيليشن الخفيفة (لوحات الحق).
- حدد من القائمة "عرض"، انتقل إلى "مناطق الذروة | تكرار المقارنة ". لوحة "ذروة المناطق – تكرار المقارنة" التي تحتوي على شريط الرسوم البيانية سوف تظهر على الجانب الأيمن من الإطار. في لوحة "المناطق الذروة"، انقر بالزر الأيمن، واختر "انتقالات | واحد "، الذي يظهر في منطقة بلغة ذروة أيون لايون الجزء المحدد. وأخيراً، زر الماوس الأيمن فوق لوحة "ذروة المناطق" وحدد "ترتيب | الوثيقة ".
- في لوحة شجرة الهدف على الجانب الأيسر من الإطار، انقر بالزر الأيمن على الببتيد "E.LCKVASLRE. T | نسب إلى | أونيهيفي "، التي تقوم بحساب نسبة أيون الخفيفة إشارة على إشارة أيونات ثقيلة، والخفيفة/الثقيلة.
ملاحظة: هذه ليست نفس نسبة الموقع شغل ستويتشيوميتري من Light/(Heavy+Light). - لاحظ أن الشجرة الهدف الآن تقارير أن نسب لتر في الساعة بحق الأيونات بلغة الضوء.
-
تحديد "أيونات يفتت التمايز" التي تحتوي على الموقع أسيلاتيون للفائدة.
ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 3، يتميز هذا المثال الدقيق، الأيونات التفريق وتحددت ذ7 (أعلى مرتبة)، ص8وب3وب4. لاحظ أن الأيونات بلغة غير التفريق إظهار نسبة 1 في شجرة الهدف.- في اللوحة اليسرى شجرة الهدف، تحت 588.30 + + العقدة الفرعية من الببتيد E.LCKVASLRE. T، انقر فوق y7 التفريق بين أيون يفتت
ك [ص7 ] – 902.49 + (rank1) [5]
لاحظ زيادة ذروة الارتفاع والمنطقة. - في اللوحة اليسرى شجرة الهدف، تحت 588.30 + + العقدة الفرعية من الببتيد E.LCKVASLRE. T، انقر على أيون بلغة غير التفريق في ص5 [ص5 ] – 575.31 + (الدرجة 6) [1]. ويلاحظ أن تبقى ص5 جزء أيون تشروماتوجرامس ومناطق الذروة في نفس النطاق لجميع العينات.
- لوحة شجرة الهدف، استعرض خلال البعض التفريق (نسبة خلاف 1) وعدم التمييز (نسبة 1) تجزئة الأيونات وإشعار بالتغييرات وأنماط في منطقة الذروة بار الرسم البياني وتشروماتوجرامس.
- تحديد مجالات ذروة الدقيق لأزواج الخفيفة والثقيلة من الأيونات التفريق بغية حساب في ستويتشيوميتري (لمزيد من التفاصيل انظر أيضا ماير et al. 4). انقر فوق "طريقة العرض | شبكة المستند "وشبكة الوثيقة سوف يطفو على السطح. في الجزء العلوي الأيسر من شبكة المستند، انقر فوق "وجهات النظر | الانتقال نتائج "للاطلاع على جدول متعدد أعمدة مع جزء أيون المعلومات، مثل الببتيد تسلسل، mz السلائف،" تكرار الاسم "، إلخ
- تغيير تنسيق التقرير إلى "محوري" بالنقر فوق "وجهات النظر" في شبكة المستند مرة أخرى واختيار "عرض تحرير" لفتح إطار "تخصيص طريقة العرض". في يمين أسفل الإطار "تخصيص العرض"، تحقق من "Pivot تكرار اسم" وحدد "موافق" لإغلاق إطار "تخصيص طريقة العرض". نلاحظ أن الآن إعادة ترتيب إطار الجدول "نتائج المرحلة الانتقالية: شبكة المستند" المجموعة "تكرار اسم" و "الاحتفاظ بالوقت"، المنطقة الخلفية، أعمدة "مرتبة ذروة" تكرار (1%، 10%، 50%، 100% سوكسينيليشن).
- الببتيد "E.LCKVASLRE. T "في الجدول" نتيجة الانتقال: شبكة المستند "، العثور على العمود" Mz السلائف "وعمود" بلغة أيون "العمود (1% succinylation) منطقة 1pct_light_sw1. نلاحظ أن هناك أيونات السلائف اثنين لهذا الببتيد، الخفيفة (Mz السلائف من 588.30 في الصفوف الأولى 8) والثقيلة (Mz السلائف من 590.32 في صفوف آخر 8).
- في العمود "بلغة أيون"، تجد صفين لايون يفتت y8 المقابلة للضوء وأيونات ثقيلة السلائف. من نفس الصفوف في العمود منطقة 1pct_light_sw1، سجل مجالات y8 للضوء (15,820)، والثقيل (1,426,461).
- في اللوحة اليسرى شجرة الهدف، تحت 588.30 + + العقدة الفرعية من الببتيد E.LCKVASLRE. T، انقر فوق y7 التفريق بين أيون يفتت
- باستخدام هذه القيم منطقة الذروة، حساب ستويتشيوميتري سوكسينيليشن، أو النسبة تعديل، وفقا للصيغة الواردة أدناه والحصول على نسبة ستويتشيوميتري من 0.01، أو 1% سوكسينيليشن، الذي يتطابق مع نسبة سوكسينيليشن الخفيفة في هذه المعرفة المخلوط:
- حساب نسبة 10% سوكسينيليشن استخدام y8 التفريق يفتت أيون ذروة مجال القيم من عمود منطقة 10pct_light_sw1، 144,953 (الضوء) و 1,188,041 (الثقيلة)، للحصول على نسبة 0.10، أو سوكسينيليشن 10% ستويتشيوميتري.
- حساب نسبة stoichiometry succinylation 100% استخدام y8 التفريق يفتت أيون ذروة منطقة القيم من عمود منطقة 100pct_light_sw1، 954,513 (الضوء) و 16,407 (الثقيلة)، للحصول على نسبة 0.98، أو سوكسينيليشن 98%.
- وبالمثل، حساب نسبة stoichiometry succinylation 1% استخدام b3 التفريق يفتت أيون ذروة منطقة القيم من عمود منطقة 1pct_light_sw1، 55,697 (الضوء) و 3,149,119 (الثقيلة)، للحصول على نسبة 0.01 أو سوكسينيليشن 1%.
- متابعة حسابات نسبة stoichiometry استخدام المعادلة لجميع الأيونات يفتت التفريق، أيونات ص وب على حد سواء، للحصول على سوكسينيليشن يسين ستويتشيوميتري القيم بالنسبة لمخاليط succinylation 1، 10 و 50 و 100%.
Representative Results
بعد الحصول على البيانات، حددت أيونات يفتت MS2 التفريق من الببتيدات أسيلاتيد proteolytic والمستخرج في وقت لاحق أيون تشروماتوجرامس (شيك) تم تجهيزها في الأفق، والضوء المقابلة وتم تصدير المناطق ذروة الثقيلة التي كانت وأخيراً المستخدمة لحساب موقع الأشغال. يبين الشكل 2 ألف مثالاً مفاهيمي كيف شيك أيون السلائف قد تظهر يضم كلا إشارات الببتيد الخفيفة والثقيلة، ويعرض الشكل 2B مثال على الجزء المقابل أيون شيكس مع الترميز باللون (أحمر = الضوء الأزرق = الثقيلة ) للتفرقة بين الأيونات جزء يحتوي على التعديلات أسيليشن يسين.
ويبين الشكل 3 البيانات الناتجة عن تجربة شغل، مثل كما هو موضح أعلاه تحليل نسب محددة مسبقاً من سوكسينيلاتيد الخفيفة/الثقيلة جيش صرب البوسنة المولدة داخليا في 1، 10، 50، أو 100%، والبت في شغل سوكسينيليشن منه. استيراد بيانات شغل ديا في أفق يمكن التصور سهلة للشجرة المستهدفة، وعرض تسلسل الببتيد، والايونات جزء للايونات السلائف الخفيفة والثقيلة (الشكل 3A). وكشفت البيانات من مرض التصلب العصبي المتعدد-ديا كل نسبة محددة سوكسينيلاتيد جيش صرب البوسنة إيمانينتلي الاختلاف النسبي في نسبة أيون7 y الخفيفة إلى الثقيلة، أيون بلغة تمييز أعلى مرتبة من المباراة الأطياف الببتيد التي تم تحديدها (المبين باللون الأحمر، الشكل 3B). ويبين الشكل 4 لمحة عامة عن النتائج المجهزة من الحساب شغل MS2 شغل النسب المئوية succinylation الإدخال من البروتين، وأكد هنا تتكون من جيش صرب البوسنة قبل سوكسينيلاتيد. شغل succinylation يسين قياسها عن 20 سوكسينيلاتيد proteolytic الببتيدات التي تم الحصول عليها من قبل التجاري-سوكسينيلاتيد جيش صرب البوسنة، سوكسينيلاتيد في نسب محددة (مثلاً، في 0، 1، 10 و 50 و 100 ٪) مبينة في الجدول 2. لكل من الببتيدات جيش صرب البوسنة proteolytic 20، المرتبة الأعلى، والتفريق MS2 أيون جزء كان المستخدمة لحساب يسين شغل سوكسينيليشن (كسوكك)، كما L/(L+H) في المائة. عموما، أظهر التقدير الكمي على أساس MS2 دقة جيدة جداً في تحديد شغل أسيليشن حتى في ستويتشيوميتريس منخفضة.
رقم 1: سير العمل ستويتشيوميتري- هي المحتضنة البروتينات (A) ثلاث مرات مع أنهيدريد الخل-د6 acetylate بقايا يسين غير معدلة. هي يهضم البروتينات القادمة، أسيتيلاتيد مع اندوبروتيناسي غلو-ج، متبوعاً بتجزئة [هبلك] من الببتيدات proteolytic استخدام الفصل اللوني لعكس المرحلة الأساسية-الأس الهيدروجيني. وأخيراً، الببتيدات يتم تحليلها بواسطة LC-مرض التصلب العصبي المتعدد استخدام ديا مع عرض نافذة متغير السلائف. (ب) سير العمل نفسه يستخدم لتحديد تغيير succinic الخل-د4ستويتشيوميتري سوكسينيليشن كما هو موضح في (أ)، ما عدا الكاشف أسيليشن الثقيلة. الشكل مقتبس من ماير وآخرون. 4 (J. مدينتنا شركة نفط الجنوب كتلة سبيكتروم.، اختيار مفتوحة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مثال من المحتمل للبيانات التي تم الحصول عليها والعمليات الحسابية ستويتشيوميتري. الضوء (A) (L) والثقيلة أيونات السلائف MS1 (ح) يحتوي على أحد يسين أسيتيلاتيد تختلف من 3 وحدات جماعية. يتم إنشاء شيكس للمغلفات النظائر الخفيفة والثقيلة على حد سواء هو مبين في الأحمر والأزرق، على التوالي. (ب) التحديد الكمي من MS2 يمكن أن يؤديها أيون بلغة شيكس من المقتنيات ديا استخدام 'التمييز' أيونات يفتت الخفيفة والثقيلة التي تحتوي على الموقع أسيتيليشن هو مبين في الأحمر والأزرق. يتم عرضها في الأسود المنقط أيونات بلغة مشتركة ولا تحتوي على هذا الموقع للتعديل. الشكل مقتبس من ماير وآخرون. 4 (J. مدينتنا شركة نفط الجنوب كتلة سبيكتروم.، اختيار مفتوحة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: أفق التصور من سوكسينيلاتيد proteolytic الببتيد جيش صرب البوسنة على مستويات أشغال مختلفة- أفق (A) "الهدف شجرة" عرض الببتيد بروتيوليتيك لكسوككفاسلري وما يترتب على ذلك تجزئة الأيونات. أفق (ب) استخراج يفتت أيون تشروماتوجرامس على مستويات متفاوتة من شغل سوكسينيليشن. أيون التفريق مرتبة أعلى، ص7، يزيد في منطقة الذروة 1، 10 و 50 و 100% مضاهاة لإدخال النسبة المئوية لجيش صرب البوسنة قبل-سوكسينيلاتيد (المتولد داخليا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تقييم ستويتشيوميتري أسيليشن جيش صرب البوسنة لجيش صرب البوسنة قبل-سوكسينيلاتيد- خمس عينات مختلفة من جيش صرب البوسنة في النسب المئوية المحددة للتعديل الثقيلة (مثلاً.، الساعة 0، 1، 10 و 50 و 100 ٪) تعرضوا لتصميم شغل MS2. وتحددت شغل الموقع عن 20 سوكسينيلاتيد جيش صرب البوسنة الببتيدات من الأيونات يفتت التفريق مرتبة أعلى لخمس عينات مختلفة من جيش صرب البوسنة في نسب محددة لتعديل الضوء (مثلاً، في 0، 1، 10، 50، و 100%). وارسم "الخط الطولي مربع" يعرض توزيع الببتيدات سوكسينيل 20 وقيم من 50% الببتيدات في 'مربع' (النسبة المئوية 25% إلى النسبة المئوية 75%) والخط الطولي العلوي يشير إلى القيم من المئين 75% بحد أقصى (100%) ويشير إلى الخط الطولي السفلي القيم من 25% النسبة المئوية للحد الأدنى (النسبة المئوية 0%). (J. مدينتنا شركة نفط الجنوب كتلة سبيكتروم.، اختيار مفتوحة). يمكن الاطلاع على التقدير الكمي للقياسات في الجدول 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الوقت (دقيقة) | % A | % ب |
| 0.00 | 100 | 0 |
| 7.27 | 92 | 8 |
| 45.27 | 73 | 27 |
| 49.27 | 69 | 31 |
| 65.27 | 61 | 39 |
| 72.27 | 40 | 60 |
| 80.00 | 10 | 90 |
| 85، 00 | 10 | 90 |
| 86.00 | 100 | 0 |
| 120.00 | 100 | 0 |
| معدل التدفق: 0.7 مل/دقيقة | ||
| المخزن المؤقت ج: 10 ملم فورمات الأمونيوم في الماء، ودرجة الحموضة 10 | ||
| المخزن المؤقت ب: فورمات الأمونيوم 10 ملم في المياه تزاول و 10% 90%، الأس الهيدروجيني 10 | ||
| ملاحظة: تعديل الرقم الهيدروجيني لكلتا المرحلتين المتنقلة إلى 10 مع الأمونيا أنيق | ||
الجدول 1: التدرج لعكس المرحلة الأساسية-الأس الهيدروجيني دون اتصال [هبلك] تجزئة. طول التدرج: 120 دقيقة المخزن المؤقت ج: 10 مم فورمات الأمونيوم في الماء، ودرجة الحموضة 10. المخزن المؤقت ب: 10 ملم فورمات الأمونيوم في الماء 90% تزاول و 10 في المائة، والرقم الهيدروجيني 10.
| L/L + ح في ٪ | L/L + ح في ٪ | L/L + ح في ٪ | L/L + ح في ٪ | L/L + ح في ٪ |
| كسوكك 0% | كسوكك 1% | كسوكك 10% | كسوكك 50% | كسوكك 100% |
| 0.2 | 1.7 | 11.1 | 50.9 | 99.2 |
| 1.2 | 2.3 | 12.3 | 49.4 | 97.6 |
| 2.9 | 3.8 | 14 | 48.6 | 99.5 |
| 0.5 | 1.8 | 11.7 | 50.8 | 99.5 |
| 0.2 | 1.7 | 11.1 | 48.3 | 98.2 |
| 0.2 | 1.2 | 11 | 47.5 | 96.1 |
| 0.3 | 1.6 | 12.8 | 51 | 99.2 |
| 3.7 | 5.2 | 14.7 | 51.9 | 89.5 |
| 1.5 | 1.8 | 12.5 | 47.2 | 91.1 |
| 0.8 | 1.5 | 11.3 | 48.4 | 96.8 |
| 0.2 | 1.6 | 13.9 | 49.7 | 98.9 |
| 0.1 | 1.1 | 10.7 | 48.2 | 98.6 |
| 0.2 | 0.9 | 10.3 | 49.4 | 99.4 |
| 0.5 | 2.5 | 17.2 | 52.3 | 97.5 |
| 0.1 | 3.5 | 20.8 | 51 | 99 |
| 0.3 | 1.9 | 10.7 | 49.6 | 98.2 |
| 2 | 1.7 | 10.9 | 47.7 | 96.3 |
| 0.3 | 1.2 | 10 | 53 | 98 |
| 1.1 | 1.8 | 12.9 | 57.9 | 94.1 |
| 0.2 | 1.4 | 11.6 | 48.6 | 98.8 |
الجدول 2: القياس الكمي للجيش الصربي البوسني المقاسة يسين succinylation شغل عن 20 سوكسينيلاتيد proteolytic الببتيدات. الببتيدات سوكسينيلاتيد التي تم الحصول عليها من قبل التجاري-سوكسينيلاتيد جيش صرب البوسنة، سوكسينيلاتيد في نسب محددة (مثلاً، في 0، 1، 10، 50، و 100%). لكل من الببتيدات جيش صرب البوسنة proteolytic 20، المرتبة الأعلى، والتفريق MS2 أيون جزء كان المستخدمة لحساب يسين شغل سوكسينيليشن (كسوكك)، كما L/(L+H) في المائة.
Discussion
ويوفر هذا البروتوكول الرواية وأسلوب دقيق لقياس acetylation يسين الخاصة بالموقع وشغل سوكسينيليشن التي يمكن تطبيقها على البروتين أكملها. يعتمد هذا الأسلوب على قياس الببتيدات الخفيفة المحلية والخارجية الببتيدات ثقيلة، التي ولدت في المختبر باستخدام الكمية أسيليشن الكيميائية للبروتينات مع الديوتيريوم أنهيدريد الخل-د6 أو سوكسينيك الخل-د4 (الشكل 1). أساليب مماثلة استخدمت وسم النظائر المستقرة من بقايا يسين غير معدلة الأصلي وإجراء القياس الكمي شغل الموقع استناداً إلى أما السلائف أيون فقط12 أو يفتت الأيونات من إدارة شؤون نزع السلاح المقتنيات13،14. هذا البروتوكول ينطبق على العديد من الخطوات أثناء إعداد نموذج لتحسين كفاءة أسيليشن وتمتد العلامات الكيميائية إلى سوكسينيليشن. وتحصل على جمع البيانات باستخدام المقتنيات ديا أيون السلائف ويفتت MS2 كثافات أيون عبر كامل نطاق أسلحة قابلة للكشف، وبالتالي تقليل تداخلات أيون يفتت. التحليل والقياس الكمي عبر الأفق، والبرامج النصية المخصصة لتطويره داخليا يسمح حساب شغل موقع الببتيدات تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا يسين وأسيليشن واحد أو أكثر في موقع واحد.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال مرحلة إعداد عينة من هذا البروتوكول، ينبغي أن تتبع عن كثب. منذ بروتوكول كامل يعتمد على كفاءة تعديل جميع يسين المخلفات الكيميائية، إلا أن هذه الخطوة ذات أهمية قصوى. أو أملاحه تتفاعل مع الأمينات الحرة، ولذلك لا بد من تجنب المحتوية على أمين المخزن المؤقت أو الملوث الجزيئات في البروتين ليساتي. أيضا خلال هذه الخطوة الواحدة أسيليشن الكيميائية، ضمان أن يعدل الرقم الهيدروجيني لخليط رد فعل العودة إلى درجة الحموضة 8 بعد كل من إينكوبيشنز الثلاثة مع كاشف الخل أسيديفيس رد الفعل هذا الخليط، وقد تشكل التفاعلات الجانبية س-أسيليشن. وعلاوة على ذلك، تمييع م 8 المحتوية على اليوريا رد فعل المخلوط إلى حوالي 0.8 م اليوريا قبل الهضم، والتحقق من أن درجة الحموضة داخل النطاق الأمثل مهم لنشاط الأمثل اندوبروتيناسي غلو-C. هو عنصر رئيسي آخر لأن البروتوكول خطوة جمع البيانات وإدخال سير ديا، الذي يتغلب على أية حالات عدم تناسق في البيانات أخذ العينات أجندة الدوحة للتنمية، والتي تسمح للتقدير الكمي على مستوى أيون بلغة MS2. واحد الميزة الرئيسية لمنهجية ضياء هو نقصان التدخلات التي عادة أكثر عرضه وإشكالية عند قياس الإشارات أيون السلائف MS1 (كما اقترح البعض من المنشورات السابقة).
ويمكن إجراء تعديلات عدة على سير العمل عند إعداد نماذج معقدة للغاية. استخدام عدد الكسور التي تجمع بعد تجزئة [هبلك] عكس المرحلة الأساسية-الأس الهيدروجيني دون اتصال يمكن تقليلها إلى أدنى تعقيد العينات المجمعة التي سيتم اكتسابها من خلال السيدة LC/"الإضافة إلى ذلك"، يمكن أن تعد الكروماتوغرافي التدرجات أيضا خلال اقتناء للسماح لأفضل الببتيد الانفصال. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام البروتياز متعددة لهضم العينات إنتاج مجموعة أكبر من الببتيدات ملصوق وزيادة تغطية بقايا يسين البروتين. يمكن إجراء يدير المحاكمة والتحسين باستخدام جيش صرب البوسنة التجارية التي تحتوي على نسب معينة من أسيتيليشن أو سوكسينيليشن.
حد واحد لهذا البروتوكول هو المبالغة شغل موقع يحتمل أن تكون طفيفة نظراً للتعديلات يسين الأخرى، مثل مثلايشن أو أوبيكويتينيشن، إلخ، في نفس الموقع4في عداد المفقودين. تحسب من مناطق ذروة التعديلات اشيل الخفيفة والثقيلة، L/(L+H)، شغل موقع على أساس الافتراض بأن المستوى الإجمالي للتعديل في موقع يسين يتكون من أسيليشن الذاتية فقط 'الضوء' (L) وكيميائيا المسمى 'الثقيلة' أسيليشن (ح). ومع ذلك، قد تشمل شغل أسيليشن المجموع الفعلي في المواقع في فيفو تعديلات أخرى خارج أسيتيليشن و/أو سوكسينيليشن. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عنها النظائر نقاء الكواشف التي تم شراؤها أنهيدريد الخل-د6 (99 ٪) وسوكسينيك الخل-د4 (> 98 ٪) قد تساهم المبالغة في تقدير صغيرة ليصل إلى 2 في المائة (سوكسينيل) أو 1% (أسيتيل) أسيليشن الذاتية المستوى4. معا، هذه أوفيريستيميشنز طفيفة إضافة إلى صعوبة التحديد الكمي للمواقع مع أقل من 1 ٪ شغل. وفرة كبيرة في الاختلافات بين كاملة كيميائيا الببتيدات أسيلاتيد الببتيدات أسيلاتيد الأصلية كما تسهم وأخطاء القياس الكمي شغل موقع المحتملة، لا سيما بالنسبة أسيلاتيد الذاتية منخفضة الببتيدات27. دراسة حديثة أجراها وينيرت وآخرون. 27 وجدت أن وفرة انخفاض الفروق بين الببتيدات كاملة أسيتيلاتيد الواحدة يمكن أن تقلل من خطأ في التقدير الكمي27.
كوانتيفيكيشنز ستويتشيوميتري التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول يمكن تحديد النقاط الساخنة أسيليشن هامة في فرضيات البروتين ونموذج خاص للتجارب المتابعة البيولوجية، مثل الطفرات موقع الموجه من بعض المواقع للفائدة. هذا البروتوكول يمكن أن تكشف أيضا عن الآثار المجتمعة لمواقع ستويتشيوميتري أسيليشن المنخفضة التي يمكن أن تمارس التأثيرات غير المباشرة أو خفية على الاستقرار الهيكلي البروتين والمترجمة البيئات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، سيتيح تنفيذ هذا البروتوكول لقياس أسيتيليشن وسوكسينيليشن وتعديلات أخرى أسيليشن يسين ممكن تتجاوز acetylation فريد ثاقبة آثار دينامية أسيليشن على البروتينات تحت مختلف الظروف البيولوجية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "المعهد الوطني للسكري في المعاهد الوطنية للصحة" والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي المعاهد الوطنية للصحة-نيدك منح R24 DK085610 (PI: Verdin هاء). وأيده ججم زمالة T32 المعاهد الوطنية للصحة (T32 AG000266، PI: J. Campisi). الكتاب الاعتراف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة يشارك منحة الأجهزة لنظام 6600 تريبليتوف في معهد باك (1S10 OD016281، PI: يتعلق جيبسون).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
| succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
| sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
| Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
| HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
| HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
| urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
| triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
| anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
| 50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
| LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
| LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
| Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
| Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
| Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
| Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
| Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
| Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
| indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
| C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
| SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
| Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |
References
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325 (5942), 834-840 (2009).
- Meyer, J. G., et al. Quantification of Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry in Proteins Using Mass Spectrometric Data-Independent Acquisitions (SWATH). J Am Soc Mass Spectrom. 27 (11), 1758-1771 (2016).
- Hirschey, M. D., Zhao, Y. Metabolic Regulation by Lysine Malonylation, Succinylation, and Glutarylation. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2308-2315 (2015).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).
- Wagner, G. R., Payne, R. M. Widespread and enzyme-independent Nε-acetylation and Nε-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix. J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends Endocrinol Metab. 23 (9), 467-476 (2012).
- Castano-Cerezo, S., Bernal, V., Rohrig, T., Termeer, S., Canovas, M. Regulation of acetate metabolism in Escherichia coli BL21 by protein N(epsilon)-lysine acetylation. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3533-3545 (2015).
- Zhang, J., et al. Lysine Acetylation is a Highly Abundant and Evolutionarily Conserved Modification in Escherichia coli. Mol Cell Proteomics. 8 (2), 215-225 (2009).
- Kuhn, M. L., et al. kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation. PLoS One. 9 (4), e94816 (2014).
- Baeza, J., et al. Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome. J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).
- Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells. J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).
- Nakayasu, E. S., et al. A method to determine lysine acetylation stoichiometries. Int J Proteomics. 2014, 730725 (2014).
- Rardin, M. J., et al. MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).
- Svinkina, T., et al. Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow. Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Schilling, B., et al. Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli. Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers. Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., et al. PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data. Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).
- Rost, H. L., et al. OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data. Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).
- Lambert, J. P., et al. Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition. Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).
- Bruderer, R., et al. Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).
- Weinert, B. T., et al. Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).
