Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante
Summary
Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell’utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.
Abstract
Informazioni sulla localization(s) spatiotemporal subcellulare di una proteina sono fondamentale per capire le sue funzioni fisiologiche nelle cellule. Proteine fluorescenti e generazione delle proteine di fusione fluorescenti sono stati selvaggiamente utilizzati come strumento efficace per visualizzare direttamente la localizzazione della proteina e la dinamica in cellule. È particolarmente utile per confrontarli con gli indicatori ben noto organello dopo co-espressione con la proteina di interesse. Tuttavia, approcci classici per la co-espressione della proteina nelle piante solitamente coinvolgono più plasmidi di espressione indipendente e quindi hanno svantaggi che includono tempo alta efficienza bassa co-espressione e variazione del livello di espressione dispendio in genetica crossing e di screening. In questo studio, descriviamo un metodo robusto e romanzo per la co-espressione di più proteine chimeriche fluorescenti nelle piante. Presenta le limitazioni dei metodi convenzionali utilizzando un vettore di espressione singola che è composto di più cassette di espressione semi-indipendente. Ogni cassetta di espressione della proteina contiene i propri elementi di espressione funzionale della proteina, e pertanto può essere regolato in modo flessibile per soddisfare la domanda di espressione diversi. Inoltre, è facile e conveniente per eseguire l’assembly e manipolazione del DNA frammenti nel plasmide di espressione utilizzando una reazione ottimizzata One-Step senza ulteriore digestione e passi di legatura. Inoltre, è pienamente compatibile con le attuali tecnologie di bio-imaging fluorescente proteine derivate e applicazioni, ad esempio FRET e BiFC. Come una convalida del metodo, abbiamo impiegato questo nuovo sistema a co-express fluorescente fusa vacuolar ordinamento recettore e proteine di membrana del trasportatore secretiva. I risultati mostrano che la sua localizzazione subcellulare di prospettiva sono gli stessi come in precedenti studi di espressione transitoria sia trasformazione genetica nelle piante.
Introduction
Proteine chimeriche fluorescenti fusione sono stati considerati come strumenti utili per studiare dinamiche intracellulare e della localizzazione subcellulare e comprendere ulteriormente le loro funzioni fisiologiche e lavoro meccanismi1,2, 3 , 4. è particolarmente utile per proteine di reporter ben noto organello co-express con la proteina in questione per illustrare meglio il suo spatiotemporal rationale, distribuzione e funzioni all’interno del sistema di endomembrane in cellule4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Una proteina di fusione fluorescenti chimerico può essere espresso in piante tramite espressione transiente e stabile trasformazione genetica, che hanno i loro rispettivi vantaggi e limitazioni9,10,11. L’espressione transitoria di una proteina è un approccio conveniente che comprende Biobalistica bombardamento-, polietilenglicole (PEG)-, o elettroporazione-mediata DNA espressione transiente in protoplasti e Agrobacterium-mediata infiltrazione di foglia in cellule vegetali intatto, come mostrato in Figura 1A, B12,13,14,15,16. Tuttavia, la co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti fusione multiple in una cella singola pianta richiede una miscela di diversi plasmidi di espressione indipendente. Così, gli svantaggi di impiegare più plasmidi per la co-espressione della proteina nelle piante sono più bassi livelli di co-espressione dovuto drasticamente riducono il rischio di diversi plasmidi entrano contemporaneamente le stesse cellule rispetto ad un plasmide singolo e la variazioni dei livelli di espressione della proteina causati dalla quantità incontrollabile casuale di ogni tipi di plasmide viene trasferito nella cella17,18. Inoltre, è tecnicamente impegnativo per introdurre diversi plasmidi di espressione indipendente in un singolo Agrobacterium per proteina co-espressione9,10,11. Di conseguenza, Agrobacterium-mediata della proteina espressione transitoria da infiltrazione del tabacco lascia solo è capace di esprimere un plasmide in un momento, come mostrato in Figura 1B. Al contrario, generazione di piante transgeniche che esprimono le proteine di fusione fluorescente viene solitamente ottenuta da Agrobacterium che trasporta un vettore di trasformazione binario. Tuttavia, il vettore binario che media il trasferimento genico e inserimento nei genomi delle piante è solo capace di esprimere una singola fusione fluorescenti della proteina (Figura 1B)9,10,12. La generazione di una pianta transgenica che esprime contemporaneamente diverse proteine chimeriche fluorescenti richiede più cicli di incrocio genetico e selezione, che può durare da mesi ad anni in base ai numeri dei geni di essere co-espressi.
L’occupazione di che un vettore di espressione singola per co-espressione delle proteine multiple in pianta è stato segnalato da alcuni precedenti studi19,20,21. Tuttavia, vari cicli di digestione enzimatica e legatura del DNA di molecole di DNA e vettori di spina dorsale sono solitamente richiesti per la generazione del plasmide finale per co-espressione della proteina o sovra-espressione. Qui, abbiamo sviluppato un metodo nuovo e robusto per cheesprimono più proteine chimeriche fluorescenti nelle piante. È un metodo altamente efficiente e conveniente che raggiunge più co-espressione della proteina nelle piante per sia l’espressione transitoria e trasformazione stabile in maniera “classica”. Impiega un singolo vettore che contiene più cassette di espressione di proteine funzionalmente indipendente per co-espressione della proteina e quindi sormonta gli svantaggi dei metodi convenzionali. Inoltre, è un sistema altamente versatile nel cui DNA manipolazioni e l’assemblaggio vengono raggiunti da una reazione di uno stadio semplice ottimizzato senza passaggi aggiuntivi di digestione del DNA e la legatura. Il principio di funzionamento è illustrato nella Figura 2. Inoltre, è pienamente compatibile con approcci attuali cellulari, biochimici e molecolari che sono basati su proteine chimeriche fluorescenti fusione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo dimostrato un metodo novello per robustamente co-esprimono proteine chimeriche fluorescenti fusione nelle piante. Esso può essere utilizzato per l’espressione transitoria e la trasformazione genetica ed è compatibile con corrente fluorescenti su base proteica bio-imaging, molecolari e biochimici applicazioni e tecnologie9,10,13 . Inoltre, essa supera le difficoltà dei metodi convenzionali che utilizzano diversi pl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Wang per utili discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Foundation Natural Science of China (NSFC, grant No. 31570001) e Fondazione di scienze naturali della provincia di Guangdong e città di Guangzhou (concedere 201707010024 e n. 2016A030313401) di H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
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