식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식
Summary
공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.
Abstract
단백질의 subcellular spatiotemporal localization(s)에 대 한 정보는 세포에서의 생리 기능을 이해 하는 중요 한. 형광 단백질 및 형광 성 융해 단백질의 생성 격렬 하 게 사용 되었습니다 효과적인 도구로 직접 단백질 지 방화 및 셀에서 역학을 시각화. 특히 관심의 단백질와 공동 식 후 잘 알려진 세포 기관이 마커를 비교 유용 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 단백질 공동 식 식물에 대 한 고전적인 접근 일반적으로 여러 개의 독립 식 플라스 미드를 포함 하 고 따라서 낮은 공동 식 효율, 식 수준 변화, 그리고 높은 시간을 포함 하는 단점을가지고 유전자 교차 및 심사 비용입니다. 이 연구에서 우리는 식물에 여러 공상 형광 단백질의 공동 식에 대 한 강력 하 고 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 여러 개의 반 독립적인 표현 카세트의 구성 된 단일 식 벡터를 사용 하 여 기존 방법의 한계를 극복 했다. 각 단백질 식 카세트 자체 기능 단백질 식 요소를 포함 하 고 따라서 그것은 유연 하 게 다양 한 식 수요에 맞게 조정할 수 있다. 또한, 그것은 간단 하 고 편리 하 게 수행 하는 어셈블리 및 조작 DNA의 추가 소화 및 결 찰 단계 없이 최적화 된 원스텝 반응을 사용 하 여 식 플라스 미드에 조각. 또한, 현재 파생 된 형광 단백질 바이오 이미징 기술 및 응용 프로그램, 무서 워, BiFC 등 완벽 하 게 호환 됩니다. 방법의 유효성 검사,으로 우리 붙일 융합 공동 급행 vacuolar 정렬 수용 체와 분 비 캐리어 막 단백질이 새로운 시스템을 채택. 결과 그들의 관점의 subcellular 지 방화는 과도 식과 유전자 변형 식물에 의해 이전 연구에서와 같이 보여.
Introduction
공상 형광 성 융해 단백질 세포 역학 및 subcellular 지 방화를 연구 하 고 그들의 생리 적 기능 및 작동 메커니즘1,2, 양지 유용한 도구로 간주 되고있다 3 , 4. 공동 익스프레스 spatiotemporal 근거, 분포, 그리고 셀4 endomembrane 시스템 내에서 복수 위해 문제의 단백질으로 잘 알려진 세포 기관이 기자 단백질에 특히 유리 하다 , 5 , 6 , 7 , 8.
공상 형광 성 융해 단백질은 과도 식 통해 식물 및 안정적인 유전자 변환, 그들의 각각 장점과 제한9,,1011에 표현할 수 있습니다. 단백질의 과도 식 biolistic 폭격-, 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함 하는 편리한 접근 이다-, 또는 protoplasts 및 AgrobacteriumDNA 과도 식 electroporation 중재-중재 하는 잎에 침투 그대로 식물 세포, 그림 1A, B12,13,14,,1516와 같이. 그러나, 단일 식물 세포에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식 여러 독립 식 플라스 미드의 혼합물을 요구 한다. 따라서, 여러 개의 플라스 미드 단백질 공동 식 식물에 대 한 고용의 단점은 동시에 동일한 셀 단일 플라스 미드에 비해 입력 몇 plasmids의 극적으로 감소 된 우연 저수준 공동 식 그리고 각 유형의 셀17,18에 전송 되는 플라스 미드의 미친 듯이 임의의 금액으로 인 한 단백질 식 레벨의 변형입니다. 또한, 그것은 기술적으로 단일 Agrobacterium 단백질 공동 식9,,1011에 대 한 여러 독립 식 플라스 미드를 도전. 따라서, Agrobacterium-담배의 침투에 의해 과도 식 나뭇잎 중재 단백질은 그림 1B와 같이 한 번에 한 플라스 미드를 표현. 반면, 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 유전자 변형 식물의 세대 보통 Agrobacterium 이진 변환 벡터를 전달 함으로써 이루어집니다. 그러나, 유전자 이동 및 식물 게놈으로 삽입 중재 이진 벡터는 단일 형광 성 융해 단백질 (그림 1B)9,,1012표현만 합니다. 여러 공상 형광 단백질을 동시에 표현 하는 유전자 변형 식물 생성 여러 라운드를 유전 교차점 및 심사, 공동 표현 될 유전자의 숫자에 따라 년 개월에서 걸릴 수 있습니다 필요 합니다.
식물에 있는 여러 단백질의 공동 식에 대 한 단일 식 벡터 이전으로 보고 되었습니다 고용 연구19,,2021. 그러나, 효소 소화의 여러 라운드 및 DNA 분자 및 백본 벡터 DNA 결 찰 일반적으로에 단백질 공동 식 또는 오버 식에 대 한 최종 플라스 미드의 생성. 여기, 우리는 공동 식물에 여러 공상 형광 단백질을 표현 하는 새롭고 강력한 방법을 개발 했습니다. 모두 과도 식에 대 한 식물에 여러 단백질 공동 식와 영광 패션에 안정적인 변화는 매우 효율적이 고 편리한 방법 이다. 그것은 단백질 공동 식에 대 한 여러 기능적으로 독립적인 단백질 식 카세트를 포함 함으로써 기존 방법의 단점을 극복 하는 하나의 벡터를 사용 합니다. 또한, 그것은 매우 다양 한 시스템은 dna에서 조작 및 어셈블리 DNA 소화 및 결 찰의 추가 단계 없이 최적화 된 간단한 원스텝 반응에 의해 달성 된다. 작동 원리는 그림 2에 나와 있습니다. 또한, 그것은 공상 형광 성 융해 단백질을 기반으로 하는 현재 세포, 분자, 및 생 화 확 적인 접근을 완벽 하 게 호환입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리 튼튼하게 공동 식물에 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 새로운 방법 설명 했다. 그것은 과도 식 및 유전자 변환 사용할 수 있으며 현재 형광 단백질 기반 바이오 이미징, 분자, 및 생 화 확 적인 응용 프로그램 및 기술9,10,13와 호환 . 또한, 그것은 단백질 공동 식에 대 한 몇 가지 개별 식 플라스 미드를 사용 하는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 유용한 토론 및 의견을 위한 왕 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 호우에는 국립 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 보조금 번호 31570001)와 및에 의해 자연 과학 재단의 광 동성 광저우 시 (no. 2016A030313401 및 201707010024 부여) 지원
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
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