Совместное выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в эффективным способом в растениях
Summary
Мы разработали новый метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растения преодолевать трудности обычных методов. Он принимает преимущество использования плазмида одного выражения, содержащего несколько функционально независимой белка, выражая кассет для достижения совместного выражения протеина.
Abstract
Информация о пространственно-временных внутриклеточных localization(s) белок имеет решающее значение для понимания ее физиологических функций в клетках. Флуоресцентные белки и поколения флуоресцентные синтез белков дико использовались как эффективный инструмент непосредственно визуализировать локализация белка и динамика в клетках. Это особенно полезно сравнить их с известным органеллы маркеры после совместного с белками проявление интереса. Тем не менее обычно включают несколько независимых выражений плазмид классические подходы для совместного выражения протеина в растениях и поэтому имеют свои недостатки, которые включают низких совместно выражение эффективности, уровня выражения вариации и высокое время расходы в генетических пересечения и скрининг. В этом исследовании мы описываем надежные и Роман метод для совместного выражение несколько химерных флуоресцентных белков в растениях. Он преодолевает ограничения обычных методов, используя одно выражение вектор, состоящий из нескольких полунезависимых выражая кассеты. Каждая кассета выражение протеина содержит элементы выражения своих собственных функциональных белков, и поэтому она может быть гибко скорректирована для удовлетворения спроса на разнообразные выражения. Кроме того это просто и удобно для выполнения сборки и манипуляции с ДНК фрагментов в выражение плазмида с помощью оптимизированного одношаговый реакции без дополнительных пищеварение и перевязка шаги. Кроме того он полностью совместим с текущей флуоресцентный белок Производные био изображений технологий и приложений, таких как ладу и БМФЦ. Как проверка метода мы использовали эту новую систему совместного Экспресс дневно сплавили вакуолярной сортировки рецепторов и несущей мембранных белков. Результаты показывают, что их перспективы субцеллюлярные локализации такие же, как предыдущие исследования переходных выражение и генетической трансформации в растениях.
Introduction
Химерных флуоресцентные синтез белков было рассматривать как полезные инструменты для изучения внутриклеточных динамика и внутриклеточных локализации и более глубокого понимания их физиологических функций и рабочих механизмов1,2, 3 , 4. Это особенно выгодно для совместного Экспресс известных органеллы репортер белки с белком, о котором идет речь, чтобы лучше проиллюстрировать его пространственно-временных обоснование, распределение и функции в системе endomembrane в клетки4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Химерных флуоресцентные синтез белка может быть выражено в растения через переходные выражение и стабильные генетические трансформации, которые имеют свои соответствующие преимущества и ограничения9,10,11. Переходных выражение протеина является удобный подход, который включает в себя баллистической бомбардировки-, полиэтиленгликоль (PEG)-, или электропорация опосредованной ДНК переходных выражение в протопласта и Agrobacterium-опосредованного проникновения лист в клетки растений нетронутыми, как показано на рисунке 1A, B12,13,14,,1516. Однако, Сопредседатель выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в одном растительной клетки требует смесь нескольких независимых выражений плазмид. Таким образом, недостатки использования нескольких плазмиды для совместного выражения протеина в растениях, низких совместно выражение из-за резко снижение шансов несколько плазмид одновременно ввести те же клетки, когда по сравнению с одной плазмида и вариации уровнях выражения протеина, вызванные неудержимо случайное количество каждого типа плазмида, передаваемых в ячейке17,18. Кроме того это технически сложно внедрить несколько независимых выражений плазмид в единый Agrobacterium белка совместного выражения9,10,11. Таким образом, Agrobacterium-опосредованной белка, переходных выражение проникновения табака выходит только способен выражения одного плазмида в то время, как показано на рисунке 1B. В отличие от поколения трансгенных растений, выражая флуоресцентные синтез белков обычно достигается Agrobacterium , который несет Двоичные преобразования вектора. Однако бинарный вектор, которая опосредует перенос генов и вставки в геномах растений способен только выражения одного флуоресцентные фьюжн белка (рис. 1B)9,10,12. Создание трансгенных растений, которая выражает несколько химерных флуоресцентных белков одновременно требует нескольких раундов генетических пересечения и отбора, которая может занять от месяцев до года в зависимости от числа генов быть совместно выразили.
Занятости, что одно выражение вектор для совместного выражение несколько белков в заводе было сообщено несколько предыдущих исследований19,,2021. Однако для генерации окончательный плазмида совместного выражения протеина или гиперэкспрессия обычно требуется несколько раундов ферментативного пищеварения и перевязка ДНК молекул ДНК и магистральной векторов. Здесь мы разработали новый и надежный метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентных белков в растениях. Это очень эффективный и удобный способ, который достигает несколько совместного выражения протеина в растениях и переходных выражения и стабильной преобразования в освященной веками моды. Он использует единый вектор, содержащий несколько функционально независимой белка выражение кассеты для совместного выражения протеина и тем самым преодолевает недостатки обычных методов. Кроме того это очень гибкая система, в которой ДНК манипуляции и Ассамблеи достигается простой одношаговый оптимизированный реакции без дополнительных шагов ДНК пищеварение и перевязки. Принцип работы показана на рисунке 2. Кроме того он полностью совместим с текущей сотовой, молекулярной и биохимической подходы, основанные на химерных флуоресцентные синтеза белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы продемонстрировали новый метод выразить энергично совместно химерных флуоресцентные синтез белков в растениях. Он может использоваться для переходных выражения и генетической трансформации и совместим с текущей флуоресцентного белка на основе био изображений, молекулярно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Ван лаборатории полезные обсуждения и комментариев. Эта работа поддерживается Национальный фонд Китая естественных наук (NSFC, Грант № 31570001) и фонд естественных наук провинции Гуандун и город Гуанчжоу (Грант № 2016A030313401 и 201707010024) для H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
