Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten
Summary
Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.
Abstract
Live Cell Imaging ist eine kraftvolle Methode, die verwendet werden, um biologische Phänomene in Einzelzellen direkt über längere Zeit zu visualisieren. Im letzten Jahrzehnt haben neue und innovative Technologien die Praktikabilität des live Cell Imaging erheblich verbessert. Zellen können jetzt im Fokus gehalten werden und kontinuierlich über mehrere Tage während gepflegt unter 37 °C und 5 % CO2 Zelle Kulturbedingungen abgebildet. Darüber hinaus können mehrere Sichtfelder aus verschiedenen experimentellen Bedingungen gleichzeitig, wodurch Hochdurchsatz-experimentelle Daten erworben werden. Live Cell Imaging bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber fixiert-Cell Imaging, da für die direkte Visualisierung und zeitliche Quantifizierung der dynamische zelluläre Ereignisse. Live Cell Imaging kann auch Unterschiede im Verhalten einzelner Zellen identifizieren, die sonst verpasst würde mit bevölkerungsbezogenen Assays. Hier beschreiben wir leben-Cell imaging Protokolle, um Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel zu beurteilen. Wir zeigen, dass Methoden, ob mitotically visualisieren Zellen sterben direkt von Mitose oder schlüpfen wieder in Interphase verhaftet. Wir beschreiben auch, wie das fluoreszierende Ubiquitination basierende Zellzyklus-Anzeigesystem (FUCCI) der Bruch der Interphase Zellen von mitotischen Schlupf geboren bewerten, die in der Lage, wieder in den Zellzyklus sind einsetzbar. Schließlich beschreiben wir eine Leben-Zelle bildgebende Methode zur Kernhülle Bruch Ereignisse zu identifizieren.
Introduction
Anti-mitotische Drogen habe lange in der chemotherapeutischen Therapien verschiedener Arten von soliden Tumoren und zeigen oft große Wirksamkeit1,2,3. Mechanistisch, diese Medikamente stören normalen mitotischen fortschreiten und Förderung der mitotischen Verhaftung in rasch proliferierenden Krebszellen. Schicksal der Zelle als Reaktion auf mitotischen Verhaftung ist jedoch sehr unterschiedlich: während ein Teil der Zellen Absterben von Zellen direkt von Mitose erfährt, andere Mitose verlassen und zurückkehren, um als tetraploide Zellen interphase (ein Prozeß benannt mitotischen Schlupf)4, 5,6,7,8. Diese Interphase Zellen Apoptose führen, ständige Zellzyklus Festnahme zu unterziehen oder sogar erneut eingeben der Zellzyklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Zellen, die mitotische Zelltod zu entziehen, durch Ausrutschen in Interphase, nur für den Zellzyklus, die nach dem Medikament entfernen, erneut eingeben können daher auf das erneute Auftreten von Krebs-Zell-Populationen beitragen. Darüber hinaus Rückfall Zellen, dass Slip von Mitose tetraploiden und tetraploidy bekannt ist, Chromosom Instabilität zu fördern, der Tumor antreibt12,13,14,15. Daher ist es wichtig, aktuelle Therapie zu optimieren, Festlegung der Faktoren, die Zelle Schicksal als Reaktion auf Anti-mitotische medikamentöse Behandlungen zu steuern.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um direkt zu beobachten und studieren das Schicksal der Zellen, die längeren mitotischen Verhaftung als Reaktion auf die Anti-mitotische Droge Paclitaxel zu unterziehen. Paclitaxel ist eine etablierte Therapie in der Klinik und hat sich als sehr wirksam in vielen Arten von Tumoren, einschließlich der Brust, der Eierstöcke und der Lunge16,17,18,19, 20. Paclitaxel, die eine Pflanze Alkaloid aus der Rinde der Eibe abgeleitet ist, stabilisiert Mikrotubuli und verhindert so deren Dynamik21,22. Während Dämpfung der Mikrotubuli Dynamik von Paclitaxel Zellzyklus Progression von G1 bis G2, nicht beeinflusst führt das Medikament zu einer nachhaltigen Aktivierung der Spindel Baugruppe Prüfpunkt während der Mitose durch die Behinderung Kinetochor-Mikrotubuli Anlage (rezensiert in der Tiefe hier23,24)25. Infolgedessen ist Anaphase Beginn in Paclitaxel-behandelten Zellen und führt zu einer längeren mitotischen Verhaftung verhindert.
Dieses Protokoll wird zunächst Ansätze zur Identifizierung der mitotischen Zellen in live Cell imaging Experimente beschreiben. Mitose kann in adhärenten Gewebekultur Zellen durch zwei deutliche zellenveränderungen biologische visualisiert werden. Erstens werden Chromosomen unmittelbar vor dem Zusammenbruch der Kernhülle hoch verdichtet. Während oft nachweisbar durch standard Phasenkontrast-Mikroskopie, Chromosom Kondensation deutlicher zu erkennen, dass Leuchtstofflampen mit diesem Label Chromosomen (z.B. eindringmittel beschriftet Histon-Proteine) Stichwörter. Zweite, mitotische Zellen können auch durch die dramatischen morphologische Veränderungen identifiziert werden, die aus Zelle Rundung ergeben.
Dieses Protokoll wird dann zeigen, wie live Cell imaging Ansätze verwenden, um das Schicksal der Zellen erleben längerer mitotischen Verhaftung zu verfolgen. Zellen in Mitose verhaftet durchlaufen eine der drei unterschiedliche Schicksale. Erstens können Zellen Zelltod während der Mitose durchlaufen. Dieses Phänomen wird leicht durch Lichtmikroskopie, visualisiert, wie sterbende Zellen zu schrumpfen, Blase und/oder Bruch eingehalten werden. Zweitens: Zellen können Mitose verlassen und zurück zurück zur ohne Chromosom Segregation oder zytokinese interphase, bezeichnet ein Prozess mitotischen Schlupf. Die enttauung der Chromosomen und/oder die Abflachung der mitotischen Zellen leicht identifiziert dieses Prozesses. Zellen, die von Mitose abrutschen auch oft unregelmäßig, Multi-gelappte Kerne anzeigen und häufig mehrere Mikrokerne5Hafen. Drittens können Zellen in Mitose verhaftet Anaphase zu initiieren und fahren Sie durch Mitose nach einer langen Verzögerung. Während ungewöhnlich bei höheren Konzentrationen des Medikaments, schlägt dieses Verhalten, dass die verhafteten Zellen den Spindel Baugruppe Checkpoint erfüllt haben können oder die Spindel Baugruppe Checkpoint teilweise geschwächt oder defekt ist. Anaphase auftreten kann durch Chromosom Segregation und anschließende zytokinese mit live Cell Imaging sichtbar gemacht werden.
Leben-Zelle Bildgebungsverfahren, das Schicksal der Zellen zu verfolgen, die mitotische Zelltod zu entziehen, durch mitotische Schlupf unterziehen werden auch beschrieben werden. Zellen, die mitotische Schlupf zu unterziehen sterben in der anschließenden Interphase, auslösen eine dauerhaftere G1 Zellzyklus Festnahme oder geben Sie den Zellzyklus um eine neue Runde der Zellteilung4zu initiieren. Ein Ansatz mit FUCCI (fluoreszierende Ubiquitination basierende Zellzyklus) Indikatorensystems der Anteil der Zellen zu bestimmen, die den Zellzyklus mitotischen Schlupf nach Wiedereintritt werden beschrieben. FUCCI ermöglicht die direkte Visualisierung des Übergangs G1/s und kann in Verbindung mit langfristigen live-Cell imaging in Vitro und in Vivo26,27verwendet werden. Das FUCCI System nutzt zwei eindringmittel markierte Proteine, verkürzte Formen des hCdt1 (Chromatin Lizenzierung und DNA-Replikation Faktor 1) und hGeminin, deren Ebenen schwingen basierend auf Zellzyklus Position. hCdt1 (verschmolzen zu einem rot fluoreszierende Protein) ist auf einem hohen Niveau in G1 Phase, wo es um DNA für die Replikation zu lizenzieren wirkt, aber ist Ubiquitinated von der E3-Ubiquitin-Ligase, SCFSkp2 präsentieren und abgebaut, während S/G2/m Phasen, um zu verhindern, dass erneute Replikation von DNA-26. Im Gegensatz dazu hGeminin (verschmolzen zu einem grün fluoreszierendes Protein), ist ein Hemmstoff des hCdt1 dessen Ebenen Gipfel während S/G2/m, aber ist Ubiquitinated von der E3-Ubiquitin-Ligase APCCdh1 und am Ende der Mitose und im gesamten G1 abgebaut 26. infolgedessen FUCCI liefert eine einfache Fluoreszenz Auslesen der Zellzyklus-Phase, wie Zellen rote Fluoreszenz während G1, und grüne Fluoreszenz während S/G2/m aufweisen. Das FUCCI System ist ein wesentlicher Fortschritt gegenüber anderen Ansätzen (z. B. Bromodeoxyuridine Färbung), proliferative Zellen zu identifizieren, weil es keine Zelle Fixierung erfordert und für die einzelne Zelle Bildgebung ohne die Notwendigkeit für zusätzliche erlaubt pharmakologische Behandlungen, Zellpopulationen zu synchronisieren. Obwohl nicht in diesem Protokoll diskutiert, wurden zusätzliche live-Cell-Sensoren auch entwickelt, um Zellzyklus Fortschreiten, einschließlich eines Helikase B Sensors für G128, DNA Ligase-RFP29 und PCDNA-GFP30 Sensoren visualisieren für die S-Phase und die jüngsten FUCCI-4 Sensor erkennt die alle Phasen des Zellzyklus-31.
Schließlich wird ein live-Zelle bildgebendes Verfahren Kernhülle Bruch erkennen beschrieben. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die nukleare Umschläge von Krebszellen instabil und neigen zu platzen, wodurch der Inhalt des Nukleoplasma und Zytoplasma zu vermischen. Dieses Phänomen bezeichnet nukleare Bruch, kann DNA-Schäden und Stimulation der angeborenen Immunantwort32,33,34,35,36,37, fördern. 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. während die zugrunde liegenden Ursachen der nuklearen Bruch unvollständig gekennzeichnet bleiben, es ist bekannt, dass Verformungen im Kernstruktur mit einer erhöhten Inzidenz von nuklearen Bruch42 korrelieren. Ein bekannter Effekt von Paclitaxel Behandlung ist die Generation der auffallend abnorme atomaren Strukturen nach Mitose; als solche wird eine Methode mit Hilfe von live-Cell imaging, um nukleare Bruch zu quantifizieren beschrieben werden, während die Erkundung auch Paclitaxel Behandlung erhöht sich die Häufigkeit der nuklearen Bruch Ereignisse. Nukleare Bruch kann durch die beobachteten Auslaufen eines nuklearen gezielt fluoreszierenden Proteins in das Zytoplasma (z. B. ein Tandem-Dimer Wiederholen des RFP verschmolzen zu einem nuklearen Lokalisierung Signal, TDRFP-NLS) erkannt werden. Diese Leckage ist deutlich sichtbar durch Auge, die einfachen Quantifizierung der Bruch Ereignisse ermöglicht.
Dieses Protokoll erfordert ein Weitfeld Epifluoreszenz-Mikroskop, das mit einem codierten Bühne und Autofokus-Software ausgestattet ist. Die codierte Bühne ermöglicht eine präzise automatische Bewegung zu definierten X / Y-Koordinaten, während Autofokus-Software für die Dauer der bildgebenden Zellen im Fokus behält. Darüber hinaus erfordert dieses Protokoll Ausrüstung weiterhin Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 befeuchtet Atmosphäre. Dies kann erreicht werden durch umschließen das gesamte Mikroskop innerhalb einer Temperatur und Atmosphäre kontrolliert Gehäuse oder mithilfe Bühne-Top-Boxen, dass lokal verwaltet, Temperatur und Umgebung. In diesem Protokoll verwendeten Phasenkontrast-Ziel ist es ein Plan Fluor 10 X mit einer numerischen Apertur von 0,30. 20 X Ziele sind aber auch ausreichend, um beide abgerundeten mitotischen und abgeflachte Interphase Zellen in eine einzelne Brennebene zu identifizieren. Wenn Phasenkontrast-durchführen kann bildgebende Verfahren (wie in diesem Verfahren beschrieben), die Abdeckung entweder aus Glas oder Kunststoff sein. Wenn differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie verwendet wird, ist es unerlässlich, eine Glasabdeckung verwenden, um zu verhindern, dass die Depolarisation des Lichts.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Aspekt der langfristigen live Cell Imaging sichert die Gesundheit der Zellen wird abgebildet. Es ist wichtig, dass die minimale äußere Umwelt Stressoren, wie unwürdigen Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit und/oder CO2 -Konzentration Zellen ausgesetzt werden. Es ist auch wichtig, lichtbedingten von fluoreszierenden Erregung Beleuchtung zu begrenzen, wie imaging Stress genannt wird, auf die Zelle Verhalten50. Begrenzung der lichtbedingten kann auf vielf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, MAV und NJG möchte Ryan Quinton für Kommentare auf dem Manuskript und Adrian salischen für das TDRFP-NLS-Konstrukt zu danken. AFB und MAV sind NIGMS biomolekularen Pharmakologie Ausbildung Grant 5T32GM008541 finanziert. NJG ist Mitglied der Shamim und Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories und stützt sich auf NIH-Stipendien GM117150 und CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, die Smith-Familie-Awards-Programm, Searle Scholars Program und Melanoma Research Alliance.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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