A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel
Summary
Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.
Abstract
Proyección de imagen de células vivas es una técnica poderosa que puede utilizarse para visualizar directamente los fenómenos biológicos en las células durante largos períodos de tiempo. En la última década, nuevas e innovadoras tecnologías han mejorado grandemente la utilidad de las imágenes de células vivas. Las células pueden mantenerse ahora en foco y continuamente reflejada durante varios días mientras se mantuvo en 37 °C y 5% CO2 condiciones de cultivo celular. Por otra parte, múltiples campos de vista representando a diferentes condiciones experimentales puede ser adquirido al mismo tiempo, proporcionando así datos experimentales de alto rendimiento. Proyección de imagen de células vivas ofrece una considerable ventaja sobre la proyección de imagen fija-cell por lo que permite la visualización directa y la cuantificación temporal de eventos celulares dinámicos. Imágenes de células vivas también pueden identificar la variación en el comportamiento de las células que de lo contrario habría sido perdido usando análisis basado en la población. Aquí, describimos protocolos imágenes de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel. Demostrar métodos para visualizar si mitotically detuvieron mueren células de mitosis o slip en interfase. También describimos cómo el sistema de indicadores (FUCCI) ciclo de celular ubiquitinación base fluorescente puede utilizarse para evaluar la fracción de células de la interfase de deslizamiento mitótico que son capaces de volver a entrar en el ciclo celular. Finalmente, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para identificar eventos de ruptura del envoltorio nuclear.
Introduction
Drogas anti-mitotic han sido utilizadas en los regímenes quimioterapéuticos de varios tipos de tumores sólidos y a menudo muestran gran eficacia1,2,3. Mecánico, estos fármacos interrumpir progresión mitótica normal y promover la detención mitótica en proliferar rápidamente las células cancerosas. Sin embargo, el destino de la célula en respuesta a la detención mitótica es muy variable: mientras que una fracción de las células sufre la muerte celular de mitosis, otros salida de mitosis y regresar a la interfase como células tetraploides (un proceso llamado mitosis deslizamiento)4, 5,6,7,8. Estas células de interfase pueden ejecutar apoptosis, someterse a detención del ciclo celular permanente o incluso volver a entrar en el ciclo celular4,5,6,7,8,9 ,10,11. Células que evaden muerte mitótica de la célula por deslizamiento en la interfase, sólo para volver a entrar en el ciclo celular después del retiro de la droga, por lo tanto pueden contribuir a la re-aparición de poblaciones de la célula de cáncer. Por otra parte, células que resbalón de mitosis son tetraploides y tetraploidy se conoce para promover la inestabilidad del cromosoma que lleva el tumor recaen12,13,14,15. Definir los factores que controlan el destino de la célula en respuesta a los tratamientos con fármacos anti-mitotic, por tanto, es fundamental para optimizar la terapéutica actual.
En este protocolo, se describen métodos para observar directamente y estudiar el destino de las células que sufren detención mitótica prolongada en respuesta a la drogas anti-mitotic paclitaxel. Paclitaxel es un establecido terapéutico en la clínica y ha demostrado ser altamente eficaz en muchos tipos de tumores, los de mama, ovarios y pulmones16,17,18,19, incluidos 20. Paclitaxel, que es un alcaloide de la planta de la corteza del árbol tejo, estabiliza microtúbulos y así previene su dinamismo21,22. Mientras que la amortiguación de la dinámica de los microtúbulos por paclitaxel no afecta la progresión del ciclo celular de los G1 a G2, la droga conduce a la activación sostenida del puesto de control de ensamblaje del huso durante la mitosis por obstaculizar accesorio de cinetocoro-microtúbulo (revisado en profundidad aquí23,24)25. Como consecuencia, se previene la inicio de la anafase en células tratadas con paclitaxel y resultado en una prolongada detención mitótica.
Este protocolo primero describe enfoques para identificar las células mitotic en experimentos de proyección de imagen de células vivas. Puede visualizarse la mitosis en células en cultivo de tejido adherente debido a dos cambios biológicos de la célula sensible. En primer lugar, los cromosomas se convierten en altamente condensados inmediatamente antes de la ruptura de la envoltura nuclear. Mientras que a menudo detectables por microscopia de contraste de fases estándar, condensación del cromosoma puede ser detectado más claramente utilizando fluorescente etiquetas etiqueta los cromosomas (por ejemplo proteínas de histona marcada con fluorescencia). En segundo lugar, mitóticas las células también pueden identificarse por los dramáticos cambios morfológicos que resultan del redondeo de las células.
Este protocolo entonces demostrará cómo utilizar enfoques imágenes de células vivas para seguir los destinos de las células experimentan prolongada detención mitótica. Las células en mitosis son sometidos a uno de tres destinos distintos. En primer lugar, las células pueden sufrir muerte celular durante la mitosis. Este fenómeno es fácilmente visualizado por microscopia ligera, como muerte de las células se observan a encogimiento, ampolla o ruptura. En segundo lugar, las células pueden tomar la salida de mitosis y retorno a interfase sin segregación cromosómica o citocinesis, un proceso denominado deslizamiento mitotic. La decondensation de los cromosomas o el aplanamiento de la célula mitótica fácilmente identifica este proceso. Las células de mitosis que muestran también a menudo núcleos irregulares, múltiples lóbulos y con frecuencia albergan varios micronúcleos5. En tercer lugar, las células en mitosis pueden iniciar anafase y proceder a través de la mitosis después de un largo retraso. Mientras que es infrecuente en concentraciones más altas de la droga, este comportamiento sugiere que las células detenidas pueden haber satisfecho el puesto de control de ensamblaje del huso, o que el puesto de control de ensamblaje del huso está parcialmente debilitado o defectuoso. Inicio de la anafase se puede visualizar por segregación cromosómica y citocinesis posterior usando proyección de imagen de células vivas.
También se describen métodos de células vivas para rastrear el destino de las células que evadir la muerte mitótica de la célula que experimenta mitotic deslizamiento. Las células que sufren mitosis deslizamiento mueren en la interfase posterior, desencadenan una durable detención de ciclo celular G1 o volver a entran en el ciclo celular para iniciar una nueva ronda de división celular4. Se describirá el enfoque utilizando el sistema de (indicador de ciclo de celular ubiquitinación base fluorescente) FUCCI para determinar la fracción de células que volver a entrar en el ciclo celular tras deslizamiento mitotic. FUCCI permite la visualización directa de la transición de G1/s y puede utilizarse en conjunción con largo plazo células vivas imágenes tanto en vivocomo en vitro 26,27. El sistema FUCCI aprovecha de dos proteínas fluorescencia de etiquetado, formas truncadas de hCdt1 (licencia de cromatina y replicación del DNA factor 1) y hGeminin, cuyos niveles oscilan en función de posición de ciclo celular. hCdt1 (unida a una proteína fluorescente roja) está presente en altos niveles en fase G1 donde actúa para licencia de ADN para la replicación, pero es ubiquitinated por el E3 ubiquitina ligasa SCFSkp2 y degradada durante las fases de /M2S/G para evitar la replicación de ADN26. Por el contrario, hGeminin (unida a una proteína fluorescente verde), es un inhibidor de la hCdt1 cuya cima de niveles durante S/G2/m, pero es ubiquitinated por el E3 ubiquitina ligasa APCCdh1 y degrada al final de la mitosis y a lo largo de G1 26. en consecuencia, FUCCI ofrece una lectura directa de la fluorescencia de la fase del ciclo celular, como las células exhiben fluorescencia roja durante la fluorescencia verde y1 G durante S/G2/M. El sistema FUCCI representa un avance significativo sobre otros enfoques (por ejemplo, tinción de bromodeoxiuridina) para identificar las células proliferativas, porque no requiere la fijación de la célula y permite la proyección de imagen de célula sin necesidad de adicional farmacológica tratamientos para sincronizar poblaciones celulares. Aunque no discutido en este protocolo, también se han desarrollado sensores adicionales de células vivas para visualizar la progresión del ciclo celular, incluyendo un sensor de helicasa B para G128, ADN ligasa-RFP29 y PCDNA-GFP30 sensores para la fase S y el reciente FUCCI-4 sensor, que detecta todas las etapas del ciclo celular31.
Por último, se describirá un método por imágenes de células vivas para detectar ruptura de la envoltura nuclear. Estudios recientes han revelado que los sobres nucleares de las células cancerosas son inestables y propensos a estallar, lo que permite que el contenido del nucleoplasia y citoplasma a intermix. Este fenómeno, llamado ruptura nuclear, puede promover daños al ADN y estimulación de la respuesta inmune innata32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mientras que las causas de la ruptura nuclear permanecen incompletamente caracterizadas, se conoce que las deformaciones en la estructura nuclear se correlacionan con una mayor incidencia de ruptura nuclear42. Un conocido efecto del tratamiento con paclitaxel es la generación de estructuras nucleares sorprendentemente anormales tras la mitosis; así, se describen un método usando células vivas la proyección de imagen para cuantificar ruptura nuclear, explorando también si paclitaxel tratamiento aumenta la frecuencia de eventos de ruptura nuclear. Ruptura nuclear puede detectarse la salida observada de una proteína fluorescente blanco nuclear en el citoplasma (por ejemplo un dímero de tándem repetición de RFP fusionado a una señal de localización nuclear, TDRFP-NLS). Esta fuga es claramente visible por el ojo, que permite la simple cuantificación de eventos de ruptura.
Este protocolo requiere un microscopio de epifluorescencia de campo amplio que está equipado con una etapa codificado y software de enfoque automático. La etapa codificada permite movimiento automatizado exacto definido coordenadas X-Y, mientras que software de enfoque automático mantiene las células en el foco para la duración del período de proyección de imagen. Además, este protocolo requiere equipo para mantener humedecían de las células a 37 ° C con 5% CO2 ambiente. Esto puede lograrse utilizando el microscopio todo dentro de una temperatura y atmósfera controlada gabinete o utilizando dispositivos de etapa superior que localmente mantiene la temperatura y el medio ambiente. El objetivo de contraste de fase utilizado en este protocolo es un fluor plan 10 x con una apertura numérica de 0.30. Sin embargo, objetivos X 20 también están suficientes para identificar las células redondeadas interfase mitótica y aplanado en un solo plano focal. En caso de fase-ponga en contraste proyección de imagen (como se describe en este método), la cubierta puede ser vidrio o plástico. Si se utiliza el microscopio de interferencia diferencial contraste (DIC), es imprescindible utilizar una cubierta de cristal para evitar la despolarización de la luz.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aspecto más crítico de las imágenes de células vivas a largo plazo es garantizar la salud de las células se va a examinar. Es esencial que las células de estar expuesto a estresores ambientales extraños mínima, como deficientes condiciones de temperatura, humedad y niveles de CO2 . También es importante limitar el fotoenvejecimiento de iluminación fluorescente de la excitación, como imagen de estrés es conocido por afectar la célula comportamiento50. Limitar el fotoenvej…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, MAV y NJG gustaría agradecer Ryan Quinton para comentarios sobre el manuscrito y Adrian Salic para la construcción de TDRFP-NLS. AFB y MAV son financiados por la beca de formación NIGMS Biomolecular Farmacología 5T32GM008541. NJG es miembro de la Shamim Ashraf Dahod mama cáncer Research Laboratories y es apoyado por subvenciones de NIH GM117150 y CA-154531 la Karin Grunebaum Foundation, el programa de premios de la familia de Smith, el programa de eruditos de Searle y la investigación del Melanoma Alianza.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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