長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために
Summary
住セルイメージ投射は、固定細胞イメージングだけで達成可能ではない単一セルまたは全体人口の豊富な情報を提供します。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング プロトコルを説明します。
Abstract
住セルイメージ投射は、直接時間の長時間にわたって単一のセルの生物学的現象を視覚化するために使用できる強力な手法です。過去 10 年間新しい、革新的な技術は、大きく住セルイメージ投射の実用性を強化しています。セルでフォーカスで保つことができるようになりました、継続的に細胞培養条件の下で維持された 37 °C と 5% CO2しながら数日間かけてイメージします。さらに、異なる実験条件を表す複数のフィールドの表示を取得できます、同時に高スループット実験データを提供します。住セルイメージ投射は、直接可視化と細胞の動的イベントの一時的な定量を可能にする、固定細胞のイメージングに重要な利点を提供します。住セルイメージ投射もだろうそうでなければ見逃している人口に基づく試金を使用して単一のセルの動作の変化を識別できます。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング プロトコルについて述べる.逮捕されたのかどうか有糸分裂を可視化する有糸分裂または中間期にタイム スリップから直接セルは死にを紹介します。蛍光ユビキチン化による細胞周期のインジケーター (FUCCI) システムを使用して、細胞周期を入力し直すことができる分裂すべりから生まれた間期細胞の割合を評価する方法についても述べる。最後に、核膜破壊イベントを識別するために生細胞イメージング法について述べる。
Introduction
抗有糸分裂薬各種固形腫瘍の化学療法で用いられてきた、しばしば素晴らしい効果1,2,3を表示します。機械論的に、これらの薬は、通常の細胞分裂の進行を妨害、急速に増殖の細胞分裂の逮捕を促進する癌細胞。しかし、分裂逮捕に応答細胞の運命は非常に変数: 有糸分裂終了など四倍体細胞 (分裂のスリッページと呼ばれる、プロセス) として中間期に戻る一方、細胞の一部を経る有糸分裂から直接細胞死、4、 5,6,7,8。これらの間期細胞がアポトーシスを実行、永久的な細胞周期停止を受けるまたはも細胞周期4,5,6,7,8,9 を再入力 ,,1011。再次の薬剤除去、細胞周期を入力するだけの中間期に入れることによって有糸分裂細胞死を回避する細胞したがって癌細胞の人口の再出現に貢献するかもしれない。さらに、細胞の有糸分裂からスリップが四倍体、tetraploidy はドライブの腫瘍染色体不安定性を促進するために知られている12,13,14,15 を再発します。現在治療を最適化するために重要なつまり抗有糸分裂薬治療への応答の細胞の運命を制御する要因を定義します。
このプロトコルで直接観察し、抗有糸分裂薬パクリタ キセル長引く分裂停止を受ける細胞の運命を研究する方法をについて説明します。パクリタ キセルは確立されたクリニックで治療、乳がん、卵巣、肺16,17,18,19,のそれらを含む多くの腫瘍型で非常に有効な証明されています20. パクリタ キセルは、イチイの樹皮から派生した植物アルカロイドである微小管を安定化し、その dynamicity21,22を防止すること。妨げることで、薬は有糸分裂の間スピンドル集合チェックポイントの持続的な活性化につながるパクリタ キセルによる微小管ダイナ ミックスの湿し水では1 G、2 G からの細胞周期の進行は影響しません動原体微小管結合 (23,24の深さをここの見直し)25。結果として、パクリタ キセル処理細胞で長期にわたる分裂停止の結果後期発症を防止します。
このプロトコルは最初生細胞イメージング実験で分裂期の細胞を識別する方法を説明します。2 つの顕著な細胞生物学的変化による付着性の培養細胞の有糸分裂を視覚化できます。まず、染色体になる高度に核膜崩壊の直前に凝縮します。一方、多くの場合標準的な位相差顕微鏡による検出、染色体凝縮より明確に検出できる蛍光タグ、ラベル染色体 (例えば蛍光標識したヒストン蛋白質)。第二に、細胞分裂のセルは、セルの丸めに起因する劇的な形態学的変化によっても識別できます。
このプロトコルは、生細胞イメージング技術を使用して長時間の細胞分裂停止が発生して細胞の運命を追跡する方法を示します。細胞の有糸分裂の逮捕を受ける 3 つの明瞭な宿命の一つ。まず、細胞は有糸分裂の間の細胞死を受けることができます。この現象は、死細胞が縮小、水疱、または破裂の観察光学顕微鏡検査によって容易に視覚化します。第二に、細胞が有糸分裂から終了することができます、中間期の染色体分離または分裂せずに戻り、プロセスは、細胞分裂の滑りと呼ばれます。染色体の decondensation および/または容易に分裂細胞の平坦化は、このプロセスを識別します。有糸分裂からスリップ細胞はまた頻繁に不規則な多裂片のある核を表示し、頻繁いくつかの小核5を抱きます。第三に、細胞分裂で逮捕できます後期を開始し、長い遅延の後細胞分裂に進みます。この現象の中には珍しい高い薬物濃度で、逮捕された細胞は紡錘アセンブリ チェックポイントを満たす可能性がある、または紡錘アセンブリ チェックポイントが部分的に弱体化や欠陥を示唆しています。後期発症は、染色体分配と住セルイメージ投射を使用してそれに続く細胞質分裂で視覚化できます。
分裂すべりを受けることによって有糸分裂細胞死を回避する細胞の運命を追跡する生細胞イメージング方法は説明もします。分裂すべりを受けるセルは、後続の相間で死ぬ、耐久性のある G1の細胞周期の停止をトリガーまたは細胞分裂4の新ラウンドを開始する細胞周期を再入力します。次の分裂すべり細胞周期を再入力セルの割合を決定する FUCCI (蛍光ユビキチン化による細胞周期のインジケーター) システムを使用する方法を説明します。FUCCI G1/S 遷移の直接可視化でき、長期的な生細胞イメージングの in vitroとin vivoの26,27と組み合わせて使用することができます。FUCCI システムは、2 つの蛍光に分類された蛋白質、hCdt1 の切り捨てられたフォームの利用 (クロマチン ライセンスと DNA 複製因子 1) と細胞周期の位置に基づいてそのレベルの振動 hGeminin。(赤の蛍光蛋白質に溶ける) hCdt1 SCFSkp2フェーズでは G1それはレプリケーションは、DNA をライセンスする行為がユビキチン E3 ユビキチンリ ガーゼによってを高いレベルで存在し、劣化を防ぐための S/G2/M フェーズ中にDNA26の再レプリケーション。対照的に、hGeminin (緑の蛍光蛋白質に溶ける)、hCdt1 の阻害剤のレベルのピーク S/G2/M 中がユビキチン E3 ユビキチンリ ガーゼ APC によってCdh1有糸分裂と G1の終わりに低下し、26します。 その結果、細胞を示す S/G2/M G1、と緑の蛍光レッド蛍光 FUCCI 細胞周期段階の簡単な蛍光読み出しを提供。FUCCI システム セル固定を必要としない単一細胞イメージングを必要とせず追加できますので、増殖性の細胞を識別するための (ブロモデオキシウリジン染色) など他のアプローチに比べて大幅な進歩は薬理学的セル人口の同期にトリートメント。このプロトコルで説明されていない、追加の生細胞センサーも PCDNA GFP30センサー、DNA リガーゼ RFP29 G128ヘリカーゼ B センサーを含む、細胞周期の進行を可視化する開発されています。S 相、最近 FUCCI 4 センサー細胞周期31のすべての段階を検出します。
最後に、核膜の破断を検出する生細胞イメージング法を説明します。最近の研究は、癌細胞の核封筒は、不安定な破裂しやすいにより、核質と混在する細胞質の内容を明らかにしました。核破壊と呼ばれる、このような現象は、DNA 損傷と自然免疫応答32,33,34,35,36,37,の刺激を促進することが38,39,40,41,42,43,44。 核破壊の根本的な原因が不完全に特徴付けられたままは、核破断42の発生率の増加と核構造の変形を関連付けることを知られています。パクリタ キセルの治療の 1 つのよく知られている効果は有糸分裂; 驚くほど異常な核構造の生成そのため、生細胞イメージングを用いた核破壊を定量化する方法もパクリタ キセル治療核破壊イベントの頻度が増加する場合を探索しながら説明されるでしょう。核破断は、細胞質 (例えば核局在化信号 TDRFP NLS に融合した RFP のタンデム ダイマーを繰り返します) に核をターゲットとした蛍光タンパク質の観察された漏出を検出できます。このリークは、破壊イベントの簡単な定量を可能にする、目ではっきりと目に見える。
このプロトコルには、エンコードされたステージ、オート フォーカス ソフトウェアが装備されている広視野落射蛍光顕微鏡が必要です。エンコードされたステージは、オート フォーカス ソフトウェア イメージングの期間の持続期間のセルにフォーカスを維持しながら定義された座標の X と Y 座標に正確な自動運動のためことができます。このプロトコルでセルと 37 ° C で湿度 5% CO2を維持するために機器が必要ですまた、雰囲気。これは温度内全体の顕微鏡を囲むことによって達成することができます、雰囲気制御エンクロージャ、またはそのローカル ステージ上のデバイスを使用して温度と環境を維持します。このプロトコルでは位相差対物レンズは計画蛍光 10 x 0.30 の開口を持つ。しかし、20 X 目的が単一焦点面の両方の丸みを帯びた細胞分裂と平坦界面セルを特定するのに足りるも。位相コントラストを実行している場合 (このメソッドで説明します)、イメージング、カバーすることができますガラスまたはプラスチック。差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡を使用する場合、光の脱分極を防ぐためにガラスのカバーを使用することが不可欠です。
Protocol
Representative Results
Discussion
長期住セルイメージ投射の最も重要な側面は、イメージされている細胞の健康を確保することです。細胞が温度・湿度・ CO2のレベルについての不良条件など、最小限の余分な環境ストレスにさらされることが不可欠です。50セルの動作に影響を与える知られているストレスをイメージングにも蛍光励起照明から光損傷を制限することが重要です。光損傷を制限する?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB、MAV NJG 原稿とエイドリアン TDRFP NLS コンストラクトの Salic コメントありがとうライアン クインしたいと思います。AFB、MAV は、日の出生体分子薬理学研修助成金 5T32GM008541 によって賄われています。NJG は、Shamim とアシュラフ Dahod 乳房がん研究所のメンバーであるおよび NIH 助成金 GM117150 と CA 154531、カリン Grunebaum 財団、スミス家族賞プログラム、サール学者プログラム、および悪性黒色腫研究に支えられて同盟。
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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