Summary

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Published: July 12, 2018
doi:

Summary

Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.

Abstract

Patienten, die überleben, Lungenentzündung erhöht Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus entlassen. Es ist vermutet worden, dass Infektion des Lungen-Gewebes während der Lungenentzündung führt bei der Herstellung von langlebigen ZELLGIFTE, die nachfolgende Ende Organversagen führen kann. Wir haben in-vitro- Tests um die Hypothese zu testen, während pulmonale Infektion entstehen ZELLGIFTE entwickelt. Isolierte Ratte pulmonalen Endothelzellen und das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa dienen als Modellsysteme und die Produktion von Cytoxins nach Infektion der Endothelzellen durch Bakterien zeigt mit Zellkulturen, gefolgt von direkte Quantifizierung mit Laktat-Dehydrogenase Assays und eine neuartige mikroskopische Methode ImageJ-Technologie. Amyloid Artder diese ZELLGIFTE wurde durch Thioflavin T Bindung Assays und Immunoblotting und Immunodepletion mit A11 Anti-Amyloid Antikörper nachgewiesen. Weitere Analysen mittels Immunoblotting nachgewiesen, dass Oligomere Tau und Aβ wurden produziert und veröffentlicht von Endothelzellen nach Infektion durch p. Aeruginosa. Diese Methoden sollten leicht anpassbar an Analysen der menschlichen klinischen Proben sein.

Introduction

Patienten, die eine Lungenentzündung zu überleben haben erhöhte Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus Entlastung1,2,3,4,5,6. In den meisten Fällen tritt der Tod durch irgendeine Art von Ende-Organversagen einschließlich Nieren-, Lungen-, Herz-, oder Leber Veranstaltungen sowie Schlaganfall5,6. Der Grund für die erhöhte Sterblichkeit bei dieser Patientengruppe wurde nie eingerichtet.

Als wird entweder ambulant erworbener Pneumonie eingestuft oder nosokomiale (nosokomiale) und Agenten, die Pneumonie verursachen können auch Bakterien, Viren, Pilze und Chemikalien. Eine der wichtigsten Ursachen der nosokomialen Pneumonie ist das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa. P. Aeruginosa ist ein gramnegatives Organismus, der eine Typ-III-Sekretion-System verwendet, um verschiedene Effektor-Molekülen, genannt Exoenzymes, direkt in das Zytoplasma der Ziel-Zellen7,8übertragen. Während der Infektion von pulmonalen endothelial Zellen gezielt die Exoenzymes verschiedene intrazelluläre Proteine, einschließlich eine endotheliale Form der Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau9,10,11,12 , was zu endotheliale Barriere Aufschlüsselung, was zu schweren Lungenödem, verringerte Lungenfunktion und oft zum Tod.

Wie bereits erwähnt, haben Patienten, die überleben die ersten Lungenentzündung Sterberaten in den ersten 12 Monaten nach Krankenhaus entlassen erhöht. Ein möglicher Mechanismus für die Erklärung dieses Phänomens ist, dass irgendeine Art von langlebigen Toxin während der anfänglichen Infektion entsteht, die schlechte Langzeitprognose führt. Zwei Beobachtungen unterstützen diese Möglichkeit. Erste, kultivierte pulmonale Endothelzellen, die ursprünglich mit p. Aeruginosa behandelt werden nicht für vermehren sich bis zu einer Woche nach der Bakterien durch Antibiotika13getötet werden. Zweite, langlebigen Prionen und Agenten mit Prion Eigenschaften wurden in verschiedene Krankheiten bei Mensch und Tier, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Nervensystem14,15nachgewiesen.

Methoden für die Prüfung der möglichen Produktion von langlebigen Zytostatika in pulmonale Infektion sind nie beschrieben worden. Hier werden eine Reihe von einfachen in-vitro- Tests beschrieben, die für die Untersuchung von Zytotoxin Produktion und Aktivität nach Infektion mit einem gemeinsamen Lungenentzündung verursachen Mittel, p. Aeruginosaverwendet werden. Diese Tests sollten leicht anpassungsfähig zu untersuchen mögliche Zytotoxin Induktion nach Infektion mit anderen Agenten, die Pneumonie verursachen, und die Überstände, die generiert werden sollte auch für die Untersuchung von Auswirkungen der ZELLGIFTE ganz nützlich sein Organe oder Tiere. Schließlich werden die Assays, die hier, am ehesten beschrieben werden anpassungsfähig, tierische und menschliche biologische Flüssigkeiten zur Herstellung von Zellgiften während einer Lungenentzündung zu testen.

Protocol

Alle tierische Verfahren wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle und Animal Care Committee von der University of South Alabama und wurden in Übereinstimmung mit allen Bundes-, Landes- und lokalen Vorschriften durchgeführt. Primärkulturen von Ratte pulmonalen mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) wurden von der Zelle Kultur Core Facility der University of South Alabama Center für Lunge Biologie erhalten. Zellen wurden mit der zuvor beschriebenen Verfahren16zubereitet. <…

Representative Results

Eine einfache in-vitro- Test wurde entwickelt, um auf das Vorhandensein von Zellgiften in Überstände von Zellen infiziert mit dem Bakterium p. Aeruginosaassay. Grundsätzlich Kulturmedium aus infizierten Zellen ist 4 h nach bakteriellen Zugabe gesammelt, die Bakterien werden durch Filter Sterilisation der Überstand Kultur entfernt und dann der sterile Überstand wird hinzugefügt, um eine neue Population von Zellen. Die Zellen sind dann 21-24 h nach der Zugabe des Üb…

Discussion

Hier werden einfache in-vitro- Methoden beschrieben, die Demonstration der Generation von zytotoxischen amyloiden während der Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Organismus erlauben. Diese Methoden umfassen eine Zelle Kultur Zytotoxizität Assay, Immunoblotting, Quantifizierung der Zelle Tötung mit ein neues mikroskopische Verfahren und ThT Bindung. Analysen der Zytostatika haben gezeigt, dass sie Amyloid in der Natur (Abbildung 2 und <strong class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde in Teilen von NIH-Stipendien HL66299 TS, RB und SL, HL60024, TS und HL136869 MF finanziert.

Materials

Rabbit anti beta amyloid Thermo 71-5800
A11 amyloid oligomer antibody StressMarq SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody EMD Millipore ABN454
Thioflavin T Sigma Aldrich T3516
HBSS Gibco 14025-092
PBS Gibco 10010-023
0.22 micron syringe filters Millipore SLGP033RS
DMEM Gibco 11965-092
HRP Goat antirabbit IgG Abcam ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin Sigma Aldrich L9381
TRITC Helix pomatia lectin Sigma Aldrich L1261
Agar Fisher BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose BioRad 162-0112
Type 2 collagenase Worthington LS004176
Fetal bovine serum Hyclone SH30898.03IH
PenStrep Gibco 15070063
Carbenicillin Disodium salt Sigma  C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off Millipore UFC801008
Potassium phosphate dibasic Sigma  795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate MP Biomedicals MP021914221
Citric Acid G Biosciences 50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9506-500G
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10277

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Cite This Article
Balczon, R., Francis, M., Leavesley, S., Stevens, T. Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (137), e57447, doi:10.3791/57447 (2018).

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