Методы для обнаружения цитотоксических Амилоиды следующие инфекции из легочного эндотелиальных клеток, синегнойной палочки
Summary
Простые методы описаны для демонстрации производство цитотоксических Амилоиды после инфицирования легочного эндотелия синегнойной палочки.
Abstract
Пациенты, которые выживают пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение нескольких месяцев после выписки из больницы. Предположили, что инфекция легочной ткани при пневмонии приводит в производстве долгоживущих цитотоксины, которые могут привести к последующей конец полиорганной недостаточности. Мы разработали в vitro анализов для проверки гипотезы, что цитотоксины производятся при легочной инфекции. Изолированные крыса легочного эндотелиальных клеток и бактерий синегнойной палочки используются как модель системы, и производство cytoxins, после инфицирования эндотелиальных клеток бактерий подтверждается с помощью клеточной культуры следуют прямые количественный, используя лактатдегидрогеназа анализов и Роман микроскопического метода ImageJ технологии. Амилоидоподобные характер этих цитотоксины был продемонстрирован Тиофлавин Т привязки анализов и immunoblotting и immunodepletion, с использованием антител анти амилоид A11. Дальнейший анализ с использованием immunoblotting продемонстрировал подготовлены и выпущенная эндотелиальных клеток после заражения P. aeruginosaолигомерных Тау и значения. Эти методы должны быть легко адаптирован для анализа человеческого клинических образцов.
Introduction
Пациенты, которые выживают пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение нескольких месяцев после больницы разряда1,2,3,4,5,6. В большинстве случаев смерти происходит некоторый тип конца полиорганной недостаточности, в том числе почек, легких, сердца, или печени события, а также ход5,6. Причиной повышенной смертности в этой популяции пациентов никогда не было установлено.
Пневмония классифицируется как приобретается либо сообщества или внутрибольничной (внутрибольничные) и агенты, которые могут вызвать пневмонию включают бактерии, вирусы, грибки и химических веществ. Одной из основных причин нозокомиальная пневмония является бактерия Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa – грамотрицательные организм, который использует систему секреции III тип для передачи различных эффекторных молекул, называемых exoenzymes, непосредственно к цитоплазме целевой ячейки7,8. Во время инфекции легочного эндотелиальных клеток exoenzymes цели различных внутриклеточных белков, включая эндотелиальной формы связанные микротрубочек белка Тау9,10,11,12 , приводит к пробою эндотелиальный барьер, что приводит к тяжелой отек легких, снижение легочной функции и, зачастую, смерть.
Как указывалось ранее, пациентов, которые выживают первоначальный пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение первых 12 месяцев после выписки из больницы. Потенциальным механизмом для объяснения этого явления является, что некоторый тип долгоживущих токсин генерируется во время первичной инфекции, что приводит к плохой долгосрочный результат. Два замечания поддерживают эту возможность. Во-первых, культивированный легочного эндотелиальных клеток, которые первоначально лечатся P. aeruginosa не размножаться на срок до недели после того, как бактерии погибают от антибиотиков13. Во-вторых, long-lived прионов и агентов с характеристиками прионных было продемонстрировано в различных заболеваний человека и животных, особенно заболеваний, связанных с нервной системы14,15.
Никогда не были описаны методы для изучения потенциального производства долгоживущих цитотоксических агентов во время легочной инфекции. Здесь изложены ряд простых в vitro анализов, может использоваться для изучения cytotoxin производства и деятельности после инфекции с помощью общей причиной пневмонии агента, P. aeruginosa. Эти анализы должны быть легко адаптируемыми расследовать возможные cytotoxin индукции после инфекции с использованием других агентов, которые вызывают пневмонию и supernatants, которые создаются также должно быть полезным для изучения эффектов цитотоксины в целом органов или животных. Наконец анализов, которые описаны здесь скорее будет адаптироваться для тестирования животных и человеческих биологических жидкостях для производства цитотоксины при пневмонии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь просто в vitro методы изложены которые позволяют демонстрация поколения цитотоксических Амилоиды во время инфекции с пневмонией, вызывая организма. Эти методы включают в себя assay цитотоксичности клетки культуры, immunoblotting, количественный ячейки, убийство с использованием Роман…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось в частях NIH грантов HL66299 TS, RB и SL, HL60024 в TS и HL136869 для MF.
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man’s friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
