Summary
På tværs af en bred vifte af tegn på sygdom, mere fysiologisk relevante modeller bliver udviklet og implementeret i drug discovery programmer. Den nye modelsystem beskrevet her demonstrerer hvordan tredimensionale tumor spheroids kan kulturperler og screenes i en høj overførselshastighed 1536-godt plade-baseret system til at søge efter nye onkologiske lægemidler.
Abstract
Kræftceller har rutinemæssigt blevet kulturperler i to dimensioner (2D) på en plastik overflade. Denne teknik, men mangler den sande miljø en tumor masse er udsat for in vivo. Solide tumorer vokser ikke som et ark fastgjort til plastik, men i stedet som en samling af klonede celler i en tre-dimensionelle (3D) plads interagere med deres naboer, og med forskellige rumlige egenskaber, såsom forstyrrelser af normal cellulære polaritet. Disse interaktioner forårsage 3D-kulturperler celler til at erhverve morfologiske og cellulære karakteristika, som er mere relevante for i vivo tumorer. Derudover en tumor masse er i direkte kontakt med andre celletyper såsom stromale og immun celler samt den ekstracellulære matrix fra alle andre celletyper. Matrixen deponeret består af makromolekyler såsom kollagen og fibronektin.
I et forsøg på at øge oversættelse af forskningsresultater i onkologi fra bænken til bedside, er mange grupper begyndt at undersøge brugen af 3D-modelsystemer i deres stof udviklingsstrategier. Disse systemer er anset for at være mere fysiologisk relevante, fordi de forsøger at sammenfatte de komplekse og heterogene miljø af en tumor. Disse systemer kan dog være ret kompliceret, og selv om imødekommenhed over for vækst i 96-brønd formater, og nogle nu selv i 384, de tilbyder få valgmuligheder for omfattende vækst og screening. Dette observeret gap har ført til udviklingen af de metoder, der beskrives her i detaljer at kultur tumor spheroids i en høj overførselshastighed kapacitet i 1536-godt plader. Disse metoder udgør et kompromis for de yderst kompleks matrix-baserede systemer, som er vanskelige at skærmen og konventionel 2D assays. En lang række kræft cellelinjer husly forskellige genetiske mutationer er med held screenet, undersøge sammensatte effektivitet ved hjælp af en kurateret bibliotek af forbindelser rettet mod Mitogen-Activated Protein Kinase eller MAPK pathway. Klumpformet kultur svar er derefter sammenlignet med svar af celler dyrkes i 2D, og differential aktiviteter er rapporteret. Disse metoder giver en unik protokol for afprøvning sammensatte aktivitet i høj overførselshastighed 3D omgivelser.
Introduction
I det seneste årti, har flere og flere undersøgelser gennemført brugen af 3D celle kultur modeller til at forstå begreber, som ikke er fuldt sammenfattet af voksende celler i 2D på plastik. Eksempler på disse koncepter omfatter vekslen i normale epitelcelle polaritet1 hvor den rumlige orientering af apikale og basal lag af celler går tabt, samt rollen, den ekstracellulære matrix i reguleringen af overlevelse og celle skæbne. Onkologi forskning, navnlig har brugt 3D modeller til at forstå grundlæggende biologi kræftceller og forskellene mellem 2D og 3D celle kultur systemer3,4. Udviklingen af mere avancerede celle kultur teknikker og deres yderligere tilpasning til multi godt formater har aktiveret søgen efter nye stoffer i 3D-indstillinger. I modsætning til celler dyrkes betingelser 2D, 3D-modeller af tumorer varierer i kompleksitet fra lagdelt mobiltelefonsystemer5 til single-celletype områder af forskellige størrelser, til komplekse multi-cell-type kugler6,7, 8. opdagelsen af nye forbindelser eller biologics, der potent inducerer celledød i disse 3D-modelsystemer er derfor af stor interesse i stof udvikling kampagner. Slutpunkterne på disse assays ofte er identiske med dem som i 2D kulturer til at vurdere ændringer i celledelingen, men da gennemført i en mere fysiologisk relevante indstilling, de kan afsløre den sande niveau af afhængighed af target gen eller pathway bliver afhørt.
Som indført ovenfor, en række modelsystemer er blevet udviklet for at studere medicin svar i 3D kultur systemer, men fleste bruger enten 96 eller 384-godt mikrotiter plader og er ikke let at tilpasse til high throughput screening (HTS) formater ofte bruges i Drug discovery screening kampagner. Sådanne systemer omfatter brugen af hængende droplet teknologier, klumpformet kulturer, pulserende celler med magnetiske partikler til at fremkalde levitation og kulturer indarbejde naturlige eller syntetiske geler som kollagen, Matrigel eller polyethylenglycol (PEG)2 . Her præsenterer vi de detaljerede metoder til en tidligere udviklet teknik til at producere 3D klumpformet kulturer fra etablerede kræft cellelinjer i 1536-godt plade format. I denne protokol, er et meget defineret medium anvendes som forhindrer udlæg i normalt vedhængende celle linjer9. Dette system har begrænsninger (dvs., det kan ikke fuldt sammenfatte en kompleks modelsystem af kræft), men alligevel, disse assays aktiverer en høj overførselshastighed screening af store samlinger af små molekyler og krydsende sammenligninger af narkotika svar mellem 2D og 3D kulturer mod en række cellelinjer og forbindelser.
Cellelinjer valgt for at vise metoder i denne artikel alle harbor mutationer i gener relateret til MAPK signalering vej, en vej, som er meget dysregulated i kræft, og for hvilke mange therapeutics er tilgængelige. Mange af linjerne har aktiveringen muterede mutationer i Kirsten rotte sarkom virus også benævnt KRAS, Neuroblastoma RAS eller de nationale tilsynsmyndigheder, Harvey rotte sarkom virus onkogen eller HRAS og de tilknyttede kinaser hurtigt accelereret fibrosarkomer, også kendt som RAFs. Seneste litteratur tyder på, at forskellige noder af denne vej-hæmmere er entydigt mere virkningsfuldt i et undersæt af cellelinjer, når de dyrkes under 3D betingelser9,10. En undersøgelse viste, at når kræftceller med aktive RAS var kulturperler i 3D, de viste en øget følsomhed over for MAPK hæmmere, og yderligere, at denne tilgang kunne identificere veje og målrettet hæmmere, der kan blive savnet i det traditionelle 2D indstilling. Målet med denne undersøgelse er at præsentere metoder til kultur disse cellelinjer, og yderligere, for at demonstrere differentieret svar til disse hæmmere, som kan observeres, når ved hjælp af 3D celle kultur systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyrkning af 1536-godt 3D Tumor Spheroids
- Forberede en frisk 3D tumor klumpformet medium stilk, (celle medium + knockout serum udskiftning + insulin-transferrin-selen) ved at tilføje de følgende reagenser til 500 mL af Dulbeccos modificerede Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicillin/streptomycin, 10 ng/mL af human Basic fibroblast vækstfaktor (bFGF), 20 ng/mL af human epidermal vækstfaktor (EGF), 0,4% bovint serumalbumin (BSA) (brøkdel V), 1 x insulin-transferrin-selen, og 1% knockout (KO) serum udskiftning (ikke fryse-tø).
- Filter-sterilisere den hel medium med kosttilskud gennem en 0,4 µm flaske-top filtreringssystem.
- Fjern kræft cellelinjer, der har været stigende anbefalede rutinemæssig kultur betingelser, fra de traditionelle cellekultur kolber ved at vaske dem 3 x med 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) og tilføjer en passende mængde af 0,25% trypsin (1 mL per 5 cm2) for 5 min til at oprette et tyndt lag over cellerne. Neutralisere trypsin med 5 x mængden af det medium, der indeholder serum og fortsætte med at tælle cellerne. For eksempel bruge 25 mL af medium til 5 mL trypsin.
- Justere koncentrationen af celle løsning til 62,5 x 104 celler/mL for at frø ialt 500 celler pr. brønd i 8 µL af klumpformet medium i 1536-godt væv-kultur-behandlede plader.
- I en biologisk sikkerhed kabinet, seed celler ved hjælp af en steriliseret, lille rustfri-stål-tippet kassette med en peristaltisk pumpe-baserede system. Mellem forskellige cellelinjer, skylle slangen af kassette med 1 x PBS og 70% Ethanol for 10 s.
- Alternativt, seed celler ved hjælp af en flydende handler ligger inden for en HEPA-filtreret rum ved hjælp af enten en steriliseret, lille rustfri-stål-tippet kassette og en peristaltisk pumpe eller en vedhæftet sprøjte pumpe, afhængigt af antallet af plader pr. cellelinje behov.
- Forsegle plader bruger en åndbar selvklæbende plade segl enten manuelt eller ved hjælp af en plade sealer.
- Læg pladerne i en spinning inkubator sat til 10 rpm og 37 ° C med 5% kuldioxid (CO2) og 95% relativ luftfugtighed. Tillad spheroids til form for 3 d.
2. dyrkning af 1536-godt 2D kræft linjer
Bemærk: 1536-godt 2D kræft linjer bør være kulturperler 24 timer før tilføjelsen af sammensat til 3D-plader.
- Forberede et 2D kræft celle medie ved at tilføje de følgende reagenser til 500 mL af en passende vækstmedium for de valgte linjer: 1 x penicillin/streptomycin og 10% føtal bovint serum (FBS).
- Filter-sterilisere den hel medium med kosttilskud gennem en 0,4 µm flaske-top filtreringssystem.
- Fjern kræft cellelinjer, der har været stigende anbefalede rutinemæssig kultur betingelser, fra de traditionelle cellekultur kolber ved at vaske dem 3 x med 1 x PBS og tilføjer en passende mængde af 0,25% trypsin (1 mL per 5 cm2) for 5 min til oprette et tyndt lag over cellerne. Neutralisere trypsin med 5 x mængden af det medium, der indeholder serum og fortsætte med at tælle cellerne. For eksempel bruge 25 mL af medium til 5 mL trypsin.
- Justere koncentrationen af celle løsning til 62,5 x 104 celler/mL for at frø ialt 500 celler pr. brønd i 8 µL af komplette mellemstore i 1536-godt væv-kultur-behandlede plader.
- I en biologisk sikkerhed kabinet, seed celler ved hjælp af en steriliseret, lille rustfri-stål-tippet kassette med en peristaltisk pumpe-baserede system. Mellem de forskellige cellelinjer, skylle slangen af kassette med 1 x steril PBS og 70% Ethanol for 10 s.
- Alternativt, frø celler ved hjælp af en flydende handler ligger inden for en HEPA-filtreret robotics rum ved hjælp af enten en steriliseret, lille rustfri-stål-tippet kassette og en peristaltisk pumpe eller vedlagte sprøjten pumpe, afhængigt af mængden af plader pr. celle Line havde brug for.
- Forsegle plader bruger en åndbar selvklæbende plade segl enten manuelt eller ved hjælp af en plade sealer.
- Læg pladerne i en spinning inkubator sat til 10 rpm og 37 ° C i 24 timer før den sammensatte tillæg, med 5% CO2 og 95% relativ luftfugtighed.
3. sammensatte tilsætning
- Forberede 8-punkt, 3-fold serielle fortyndinger af MAPK hæmmere i 100% dimethylsulfoxid (DMSO) på en væske-håndtering robot med en 10 mM top koncentration. Proteasom hæmmer Bortezomib bruges som positiv kontrol for en komplet celle dræbe for at bestemme det dynamiske område af analysen.
- Quick-spin alle assay plader og sammensatte plader på 100 x g at indsamle enhver kondens. Fjern den selvklæbende segl fra hver plade og Placer en plade på en akustisk dispenser set-up til at tilføje en i alt 8 nL i hver sammensatte/fortynding repræsenterer en endelig koncentration på 0,1% DMSO pr. brønd og en top sammensatte dosis på 10 µM.
- Efter tilsætning af sammensat er færdig, placere en specialfremstillet, rustfrit stål celle kultur låg, som forhindrer fordampning på pladen, og pladen anbringes i en spinning inkubator ved 37 ° C til 5 d, med 5% CO2 og 95% relativ luftfugtighed.
4. påvisning reagens tilsætning og tilegnelse af rådata
- Pre varme et passende volumen af en celle lysis reagens indeholdende luciferin for at registrere ændringer i-adenin-trifosfat (ATP) og dermed ændringer i celledelingen ved stuetemperatur eller i et 37 ° C vandbad. Tilføje ialt 3 µL påvisning reagens til hver brønd med en peristaltisk pumpe og inkuberes plade ved stuetemperatur i mindst 15 min.
- Fange luminescence på en plade luminometrisk.
5. databehandling
- Uddrag de rå data fra instrumentet og normalisere alle felter, der indeholder test forbindelser til gennemsnittet af alle brønde som indeholder DMSO alene som kontrolelementet neutral. Denne værdi beregnes procentvis væksthæmning af hvert stof. Dette er afsluttet, ved hjælp af formel-funktionen i Microsoft Excel hvor f (x) = {(prøve værdi relativ lys enheder (RLUs) / (gennemsnitlig DMSO værdi RLUs) * 100)}.
- Generere dosis-respons-kurver og hæmmende IC50s ved graftegning værdierne af de normaliserede data fra trin 5.1 mod sammensatte koncentrationen ved hjælp af en graftegning program.
Bemærk: Vi analyseret data ved hjælp af Helios, en indre NIBR softwareværktøj. For at fuldføre denne funktion, valgte vi ikke-parametrisk kurve analyseværktøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En række etablerede kræftcelle linjer kendt for at vokse godt på 2D kultur betingelser blev testet ved hjælp af de metoder, der er skitseret her. Repræsentative billeder fra en bred vifte af MAPK mutant kræft cellelinjer (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS og KNS-62:HRAS) ses i figur 1. Disse billeder viser, at selv om cellelinjer har forskellige morfologier, hver dannet 3D strukturer i 1536-godt assay plader. Figur 2 viser, at, når det anvendes til omfattende screening, kan differential sammensatte følsomhed mellem kulturer, dyrket i 2D versus dem i 3D observeres. Hver prik på grafen repræsenterer én sammensatte hæmmende koncentration hvor der er en 50% celle drab eller den sammensatte IC50 svar i begge indstillinger. For at demonstrere, at effekten ikke er medieret udelukkende af de forskellige medier, var Calu-6 celler kulturperler i de samme medier ved hjælp af enten 2D væv-kulturperler plader eller 3D Scivax biofilm plader, som forhindrer vedhæftet fil. Øget følsomhed eller lavere IC50 for 3D vækst tilstand er set i supplerende figur 1 for to forbindelser i det samme medie. Linjer som Calu-6 viser en øget følsomhed over for stofferne, når de dyrkes under 3D betingelser, mens linjer som SK-MEL-30 er mindre følsomme i 3D i forhold til 2D. Tabel 1 indeholder yderligere baggrundsinformation om alle cellelinjer, der blev brugt i dette skærmbillede.
Eksempler på repræsentative dosis-respons-kurver er visualiseret i figur 3. Denne figur viser differential effekten af to forbindelser, RAF265 (figur 3A) og RAF709 (figur 3B), som hæmmer aktiviteten af RAF kinaser. Begge forbindelser er mere potent i 3D betingelser i Calu-6, som er en ikke-småcellet lungekræft linje husly Q61K, en aktiverende mutation i protein KRAS. På samme tid er begge forbindelser ligeledes potent i 3D spheroids og 2D kulturer fra HCT116 kolon kræft linje, som indeholder aktivering af G13D mutationen i KRAS. For at demonstrere, at effekten af den øgede følsomhed er medieret af vækst tilstand af 3D versus 2D og ikke blot af de forskellige medier betingelser, Calu-6 celler blev dyrket ved hjælp af FBS begge betingelser. Som det ses i supplerende figur 1, når både 2D og 3D betingelser anvendelse FBS, viser den 3D kultur stadig en øget følsomhed over for de forbindelser, der producerer en lavere IC50.
Endelig, 3D analysen også tilladt en observation af fænomenet med paradoksale vækst aktivering, der vides at forekomme, når der er en ufuldstændig hæmning af RAF dimerer i stærkt aktiveret RAS mutant linjer og ikke i dimer-uafhængig pathway aktivering fundet i BRAF V600E mutationer11,12. Denne aktivering ses i figur 4, ved behandling med BRAF hæmmer Dabrafenib 3D betingelser i KNS-62, en HRAS-muteret lille celle lung cancer linje, og også i cellen atypiske-BRAF mutant i bugspytkirtlen linje BxPC-3. Væksten er aktiveret ved lave koncentrationer af stoffet, og væksten er kun undertrykt i høje koncentrationer af stoffet (figur 4B). Denne aktivering var overraskende ikke set i KRAS mutant linje Calu-6 og kan ikke forventes i den V600E BRAF mutant linje A375. Vi har observeret en paradoksal aktivering af Calu-6 ved hjælp af andre 3D vækst modeller (data ikke vist).
Figur 1: repræsentative billeder af kræftceller vokser i 3D 1536-godt plader. Celler var belagt for i alt 3 d i 1536-godt plader ved hjælp af en reagens dispenser og en lille kassette. Bright-feltet billeder, erhvervet på en inverteret mikroskop ved hjælp af en 4 X linse, demonstrere de forskellige 3D morfologier i MAPK mutant cellelinjer Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS og KNS-62:HRAS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: en scatter plot sammenligning 2D - versus 3D-sammensatte effekten på tværs af cellelinjer. Spheroids, der tidligere blev genereret for 3 d, blev derefter behandlet med forbindelser til en yderligere 5 d før sammensatte effekten blev fastsat. Hver cirkel repræsenterer en unik sammensatte reaktion. Ændringer i celle spredning blev fundet ved hjælp af en lytisk celle spredning reagens, og IC50s blev beregnet ved hjælp af en fire-parameter logistic regressionsanalyse med den interne software kaldet Helios. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: dosis-respons kurver sammenligne 2D - versus 3D-sammensatte effektivitet. Dosis-respons-kurver viser sammensatte effekten i forhold til kontrolelementerne DMSO. Kurver af KRAS mutant Calu-6 og HCT116 celler behandles med to RAF-hæmmere, RAF265 og RAF709, vises her som en procentdel i ændringen i cellevækst (% væksthæmning) i forhold til DMSO styre brønde. En befolkning på de celler, der blev dyrket 2D betingelser vises med rødt, og de dyrkes som 3D spheroids er i blå. De ubrudte linjer omkring dataene, der angive 95%-konfidensintervallerne for hvert datasæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: visse 3D kulturer fange fænomener som paradoksalt vækst aktivisering. Dosis-respons-kurver viser sammensatte effekten (% væksthæmning) sammenlignet med DMSO kontrol. Kurver af KRAS mutant Calu-6, BRAF V600E mutant A375, HRAS mutant KNS-62, og de atypiske BRAF mutant BxPC-3 celler behandles med en paradoksal activator Dabrafenib vises her. En befolkning på de celler, der blev dyrket 2D betingelser vises med rødt, og de dyrkes som 3D spheroids er i blå. De ubrudte linjer omkring dataene, der angive 95%-konfidensintervallerne for hvert datasæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: dosis-respons kurver sammenligne 2D - versus 3D-sammensatte effekten i FBS indeholdende media. Dosis-respons-kurver viser sammensatte effekten i forhold til kontrolelementerne DMSO. Kurver af KRAS mutant Calu-6 celler behandles med to RAF-hæmmere, RAF265 og RAF709, vises her som en procentdel i ændringen i cellevækst (% væksthæmning) i forhold til DMSO styre brønde. En befolkning på de celler, der blev dyrket 2D betingelser vises med rødt, og de dyrkes som 3D spheroids er i blå. Begge betingelser anvendelse FBS-holdige medier. Fejllinjer udgør standardafvigelser fra 2 enkelte datasæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Cell linie navn | Afstamning | BRAF | RAS |
| A-375 | Melanom | V600E | WT |
| BxPC-3 | I bugspytkirtlen | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | Ikke-småcellet lungekræft | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | Kolorektal | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | Melanom | WT | DE NATIONALE TILSYNSMYNDIGHEDER Q61L |
| KNS-62 | Planocellulære lunge | WT | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | Lunge | WT | DE NATIONALE TILSYNSMYNDIGHEDER G12D |
| PANC-1 | I bugspytkirtlen | WT | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | Melanom | WT | DE NATIONALE TILSYNSMYNDIGHEDER Q61K |
Tabel 1: Linje celleoplysninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder, der præsenteres her dokumentere en detaljeret protokol om, hvordan man producerer tumor spheroids i 1536-godt plader for store sammensatte screeninger. Disse metoder var oprindeligt tilpasset fra arbejde på National Cancer Institute hvor tumor spheroids blev dyrket i lav-overførselshastighed assays i 6-godt og 96-brønd plader til at stille spørgsmål om genetiske afhængigheder og sammensatte følsomhed13, 14 , 15. en kritisk og unikke træk ved denne protokol er at spheroids dannes fra traditionelle 2D væv-kulturperler celler i 1536-plader ved hjælp af definerede medier benævnt SCM + KO + ITS. Når cellerne udsås i, at varerne er forseglet med åndbar selvklæbende plade sæler til at undgå enhver fordampning over varigheden af 3 d klumpformet dannelse. Spheroids kan også dyrkes i længere perioder ved hjælp af denne fremgangsmåde16. Efter 3 d af kugle dannelse, er forbindelser tilføjet for 5 d før boltpistoler ændringer i cellevækst med en lytisk-baserede spredning reagens. Efter normalisering-kontrolhullerne og beregning af IC50s mellem celler dyrkes i 2D vs 3D, ændringer i de sammensatte-behandlede celler er i forhold til kontrol-behandlede celler.
Siden 1536-godt plader er regelmæssig væv-behandlede plader og ikke hydrogel-belagt eller celle-frastødende plader, en begrænsning af denne protokol brug af den definerede medium, som er en kritisk faktor for en vellykket gennemførelse af denne protokol. KO serum udskiftning blev i første omgang testet for sin evne til korrekt støtte i væksten af embryonale stamceller i 3D17 og i denne protokol er blevet tilpasset for væksten af mange tumor klumpformet linjer13,15, 18 , 19. at bemærke er, at selv om medier betingelserne er forskellige for væksten af 2D celler versus 3D spheroids, har vi tidligere påvist at differentieret virkningerne af narkotika følsomhed er medieret af formatet vækst og ikke blot forskellene i medierne sammensætning9.
For at sikre succes i denne protokol, som et fejlfindingstrin, foreslås det, at en række assay udvikling eksperimenter foretages først for at optimere hver cellelinje før der iværksættes en storstilet skærm. I dette eksempel blev alle cellelinjer analyseres først evalueret for at afgøre, hvis de kunne være seedet på samme udgangspunkt tætheden af 500 celler pr. brønd. De blev derefter analyseret med DMSO-only plader til at undersøge standardafvigelserne (SD) og koefficienter af varians (CVs) for varigheden af perioden vækst. Selv med denne assay udvikling sted, visse linjer voksede hurtigere end andre, og det ville have været gavnlig for yderligere optimere de seeding tætheder og varigheden af forsøget med disse mere udfordrende linjer. Endelig dokumentere data præsenteres her at der er en tendens, snarere end et universelt fænomen, for visse cellelinjer som NSCLC linje Calu-6 for at være entydigt mere følsomme over for forbindelser målretning MAPK pathway i 3D i forhold til dem, der dyrkes i 2D. Yderligere eksperimenter er undervejs for at afgøre, hvad biologiske mekanismer kan være medvirkende til at regulere denne slående forskel i følsomhed.
Evnen til at skærmen spheroids i en ultra-HTS indstilling tillader 3D kulturer skal bruges tidligt i drug discovery proces og kan aktivere identifikation af roman kemiske stof, der er kun aktiv i 3D omgivelser. Med kan så mange kliniske kandidater aldrig kommer på markedet på grund af en manglende effekt i patienter, omend demonstrerer vækst hæmning in vitro og regression i vivo, hold har startet afhøring om gennemførelsen af 3D-undersøgelser slå bro over denne kløft tidligere under søgningen. Der findes en række forskellige plade typer kultur celler i 3D, når du bruger 96-brønd eller 384-godt metoder. Her har vi præsenteret 1536-godt metoder, der producerer flere foci af individuelle spheroids. I fremtiden kunne disse resultater sammenlignes med lignende skærme ved hjælp af nye teknologier, som er under udvikling som 1536-godt plader, som kunne vokse celler som hængende dråber eller plader som er belagt med hydrogel/Matrigel og der er runde-bunden, som ville muliggøre dannelsen af en sfære pr. brønd. Disse betingelser ville indføre yderligere lag af kompleksitet til dyrkningsbetingelserne anvendes til screening, hvilket gør dem endnu mere fysiologisk relevante, og kan potentielt udgøre en øget hyppighed af oversættelse fra bænken til bedside for roman behandlingsformer. Disse teknologier vil også aktiverer videnskabelige spørgsmål involverer hypoxi eller diffusion forløb, som kræver brug af større spheroids.
Metoderne, der præsenteres her fokus på screening disse spheroids mod et lille molekyle bibliotek af forbindelser. I fremtiden kunne disse metoder udvide til at screene for romanen biologics og biotherapeutics som bi-specifikke antistoffer eller antistof-drug konjugater, hvor 3D kulturer kan give mere fysiologisk relevante antistof-antigen interaktioner. Desuden kan brug af 3D spheroids være afgørende for at udvikle sygdom-relevante assays til forståelse mål og indsatser i den fremspirende immuno-onkologi plads21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er medarbejdere i Novartis, og nogle medarbejdere er også aktionærer.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Marc Ferrer på National Center for fremme translationel videnskab, National Institutes of Health for hans støtte og vejledning til den indledende udvikling af disse assays. Derudover vil vi gerne takke Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling og Vesselina Cooke for deres videnskabelige input og drøftelser som projekt teammedlemmer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
