Summary

Ultra basse génome d’entrée séquençage bibliothèque préparation à partir d’un seul spécimen Tardigrade

Published: July 15, 2018
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Summary

Contamination pendant le séquençage génomique des organismes microscopiques demeure un grand problème. Ici, nous montrons une méthode pour séquencer le génome d’un tardigrade un seul spécimen avec aussi peu que 50 pg d’ADN génomique sans amplification du génome entier pour minimiser le risque de contamination.

Abstract

Tardigrades sont des animaux microscopiques qui entrent dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose face à la dessiccation et peuvent revenir à leur état d’origine lorsque l’eau est fournie. Le séquençage génomique des animaux microscopiques tels que la contamination bactérienne de risques tardigrades qui conduit parfois à des interprétations erronées, par exemple, au sujet de l’étendue du transfert horizontal de gènes chez ces animaux. Ici, nous fournissons une méthode d’entrée ultra basse pour séquencer le génome du tardigrade, Hypsibius dujardini, un seul spécimen. En employant l’exclusion de lavage et contaminant rigoureuse avec une extraction efficace de 50 ~ 200 pg d’ADN génomique d’un seul individu, nous avons construit une bibliothèque séquencée avec un instrument de séquençage de l’ADN. Ces bibliothèques ont été hautement reproductible et impartiale, et une analyse informatique des lectures séquencés avec autres génomes H. dujardini a montré une quantité minime de contamination. Cette méthode peut être appliquée à des tardigrades impossibles qui ne pourraient pas être séquencés à l’aide des méthodes précédentes.

Introduction

Tardigrades sont des animaux microscopiques peuvent entrer dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose, face à la dessiccation. Ils récupèrent de l’absorption de l’eau1,2. Dans l’état d’ametábolos, les tardigrades sont capables de tolérer des divers environnements extrêmes, incluent des températures extrêmes pressions et3 4,5, une dose élevée de lumière ultraviolette6, rayons x et rayons gamma 7 , 8et9de l’espace cosmique. Données génomiques sont un fondement indispensable pour l’étude des mécanismes moléculaires d’anhydrobiose.

Les tentatives précédentes pour séquencer le génome de tardigrades ont montré des signes de contamination bactérienne10,11,12,13,14. Séquençage génomique de ces petits organismes nécessite un grand nombre d’animaux et est sujets à une contamination bactérienne ; donc, nous avons déjà établi un protocole de séquençage en utilisant une méthode de saisie ultra basse à partir d’un seul spécimen de tardigrade, pour minimiser les risques de contaminations15. En utilisant ces données, nous avons effectué davantage une renumérotation de haute qualité et le remontage du génome de H. dujardini16,17. Ici, nous décrivons en détail cette méthode de séquençage génomique d’un seul individu tardigrade ()Figure 1). La validation de cette méthode de séquençage est au-delà de l’objectif de ce document et a déjà été abondamment discutée dans notre précédent rapport16.

Cette méthode se compose de deux parties : l’isolement d’un tardigrade unique avec le plus bas possible de la contamination et l’extraction de la qualité des niveaux du pictogramme de l’ADN. Le tardigrade est affamé et rincée avec l’eau, mais aussi des antibiotiques et observé au microscope avec un grossissement de X 500 à garantir l’élimination de toute contamination bactérienne. Les mesures et les estimations précédentes montrent qu’un seul individu de tardigrade contienne environ 50-200 pg de génomique DNA16, qui en est extraite par craquage de l’exosquelette de chitine par cycles de gel-dégel ou par homogénéisation manuelle. Cet ADN génomique est soumis à la construction de la bibliothèque et séquencé sur un instrument de séquençage de l’ADN. Une analyse informatique supplémentaire montre séquençage de haute qualité, mais aussi de faibles niveaux de contamination par rapport aux précédents projets de séquençage tardigrade.

Protocol

1. préparation Préparer un gel d’agarose de 2 % avec de l’eau distillée (DW) comme solvant dans une boîte de Petri en plastique de 90 mm et 10 mL d’un cocktail avec DW 1 % pénicilline/streptomycine. Le gel peut être conservé pendant 2 à 3 semaines dans un incubateur à 18 ° C.NOTE : Éviter tout stockage du gel inférieures à 10 ° C, pour la basse température va diminuer le gel d’agarose, résultant dans un espace minuscule entre le gel et le mur plat de culture dans laquelle les tardig…

Representative Results

Exclusion de contaminant : Ce protocole implique un lavage complet de la Tardigrada et une stérilisation avec un traitement d’antibiotiques pour minimiser la contamination. Elle comporte également un processus de vérification visuel pour s’assurer de la conformité de ces processus. Une image microscopique faite lors de la validation (étape 2.4 du protocole) est illustrée à la Fig…

Discussion

La contamination bactérienne constitue une menace pour le séquençage génomique des organismes microscopiques. Alors que des études antérieures sur le séquençage du génome tardigrade ont filtré de contamination en utilisant une vaste informatique méthodes12,20, ils ont séquencé le génome d’un seul individu pour minimiser les risques de contaminations. Comme un tardigrade individuel contient environ 50-200 pg d’ADN génomique16</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Nozomi Abe, Yuki Takai et Nahoko Ishii pour leur soutien technique dans le séquençage génomique. Ce travail a été soutenu par la subvention pour la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) Research Fellow, KAKENHI subvention des jeunes scientifiques (No.22681029) et KAKENHI subvention pour la recherche scientifique (B), n° 17 H 03620 de la JSPS, par un Subventions pour projets de recherche base scientifique de la Fondation Sumitomo (No.140340) et en partie par le Fonds de recherche du gouvernement Yamagata de la préfecture et ville de Tsuruoka, Japon. Chlorella vulgaris utilisé pour nourrir les tardigrades était une gracieuseté de Chlorella Industry Co. Ltd.

Materials

SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

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Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

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