Summary

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Published: July 15, 2018
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Summary

Contaminación durante la secuenciación de organismos microscópicos sigue siendo un gran problema. A continuación, os mostramos un método para secuenciar el genoma de un tardígrado de una sola muestra con tan poco como 50 pg de ADN genómico sin amplificación del genoma entero para minimizar el riesgo de contaminación.

Abstract

Tardígrados son animales microscópicos que entran en un estado ametabólico anhydrobiosis llamados frente a la desecación y puede volver a su estado original cuando se suministra agua. La secuenciación genómica de los animales microscópicos como la contaminación bacteriana de tardígrados riesgos que a veces conduce a interpretaciones erróneas, por ejemplo, en relación con el grado de transferencia horizontal del gene en estos animales. Aquí, ofrecemos un método de entrada ultrabajo para secuenciar el genoma de tardígrado, Hypsibius dujardini, de una sola muestra. Empleando la rigurosa exclusión de lavado y contaminante junto con una extracción eficiente del 50 ~ 200 pg de ADN genómico de una sola persona, construimos una biblioteca ordenada con un instrumento de la secuencia de ADN. Estas bibliotecas fueron altamente reproducible y objetiva, y un análisis de informática de la Lee secuenciado con otros genomas de H. dujardini mostró un mínimo de contaminación. Este método puede aplicarse a unculturable tardígrados que no podrían ser secuenciados utilizando los métodos anteriores.

Introduction

Tardígrados son animales microscópicos que pueden entrar en un estado ametabólico llamado anhydrobiosis frente a la desecación. Se recuperan por la absorción de agua1,2. En el estado de ametabólica, los tardígrados son capaces de tolerar ambientes extremos distintos, que incluyen temperaturas extremas3 y presiones de4,5, una alta dosis de luz ultravioleta6, rayos x y rayos gamma 7 , 8y9de espacio cósmico. Datos genómicos están un fundamento indispensable para el estudio de mecanismos moleculares de anhydrobiosis.

Los intentos anteriores para secuenciar el genoma de tardígrados han mostrado señales de contaminación bacteriana10,11,12,13,14. Secuenciación de estos pequeños organismos requiere una gran cantidad de animales y es propenso a la contaminación bacteriana; por lo tanto, previamente hemos establecido un protocolo de secuenciación utilizando un método ultra bajo de la entrada a partir de una única muestra de tardígrado, para minimizar el riesgo de contaminación15. Con estos datos, hemos realizado más un resecuenciación de alta calidad y el ensamblado del genoma de H. dujardini16,17. Aquí describimos en detalle este método de secuenciación de un solo individuo tardigrade ()figura 1). La validación de este método de secuenciación es más allá del enfoque de este trabajo y ya se ha discutido exhaustivamente en nuestro anterior informe16.

Este método se compone de dos partes: el aislamiento de un tardígrado solo con el más bajo posible de la contaminación y la extracción de alta calidad de niveles de pictograma de ADN. El tardígrado es hambre y enjuagarse con agua, así como antibióticos y observado bajo un microscopio con 500 aumentos para asegurar la eliminación de cualquier contaminación bacteriana. Mediciones y estimaciones previas muestran que un solo individuo de tardígrado contiene aproximadamente 50-200 pg de genomic DNA16, que se extrae por agrietar el exoesqueleto de quitina por ciclos de hielo-deshielo u homogeneización manual. Este ADN genómico es enviado a la construcción de la biblioteca y ordenado en un instrumento de la secuencia de ADN. Un análisis de informática adicional muestra la secuencia de alta calidad, así como bajos niveles de contaminación en comparación con anteriores proyectos de secuenciación tardigrade.

Protocol

1. preparación Preparar el gel de agarosa al 2% con agua destilada (DW) como solvente en una placa de cultivo de plástico de 90 mm y 10 mL de un 1% penicilina/estreptomicina cóctel con DW. El gel puede almacenarse durante 2-3 semanas en una incubadora a 18 ° C.Nota: Evite cualquier almacenamiento de información de gel por debajo de 10 ° C, para la baja temperatura reducirá el gel de agarosa, resultando en un espacio minúsculo entre el gel y la pared del plato de cultura en la que los tardígrados pu…

Representative Results

Exclusión de contaminantes: Este protocolo trata de un lavado exhaustivo de una esterilización con tratamiento de antibióticos para minimizar la contaminación y el tardígrado. También implica un proceso de control visual para asegurar la integridad de estos procesos. Una imagen de microscopio en la validación (paso 2.4 del Protocolo) se muestra en la figura 2. Cuando se obser…

Discussion

La contaminación bacteriana es una amenaza para la secuenciación de organismos microscópicos. Mientras que estudios anteriores sobre la secuenciación del genoma tardigrade han filtrado contaminación empleando métodos de informática amplia12,20, hemos secuenciado el genoma de un solo individuo para minimizar el riesgo de contaminación. Puesto que un tardígrado individual contiene aproximadamente 50-200 pg de ADN genómico16 y es en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Nozomi Abe Yuki Takai y Nahoko Ishii por su apoyo técnico en la secuencia genomic. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) investigador KAKENHI subvenciones para jóvenes científicos (No.22681029) y KAKENHI subvenciones para investigación científica (B), no. 17 H 03620 desde las JSP, por un Subvención para proyectos básicos de investigación de ciencia de la Fundación de Sumitomo (No.140340) y en parte por fondos de investigación del gobierno de la Prefectura Yamagata y ciudad de Tsuruoka, Japón. Chlorella vulgaris utilizado para alimentar los tardígrados fue cortesía de Chlorella Industry LTD. Co.

Materials

SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

References

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Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

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