Summary

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Published: July 15, 2018
doi:

Summary

Kontamination während der Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Organismen bleibt ein großes Problem. Hier zeigen wir eine Methode um das Genom der Bärtierchen aus einem einzigen Exemplar mit so wenig wie 50 Pg genomic DNA ohne Verstärkung des gesamten Genoms zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu sequenzieren.

Abstract

Bärtierchen sind mikroskopisch kleine Tiere, die einen Ametabolic Staat eingeben genannt Anhydrobiosis gegenüber Austrocknung und kann in ihren ursprünglichen Zustand zurück, wenn Wasser zugeführt wird. Die Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Tieren wie Bärtierchen Risiken bakterielle Kontamination, die manchmal führt zu falschen Interpretationen, zum Beispiel über den Umfang der horizontalen Gentransfer bei diesen Tieren. Hier bieten wir eine Frequenzverschiebungen Eingabemethode um das Genom der Bärtierchen Hypsibius Dujardini, aus einem einzigen Exemplar zu sequenzieren. Durch den Einsatz von strengen waschen und Schadstoffbelastung Ausgrenzung sowie eine effiziente Extraktion der 50 ~ 200 Pg genomische DNA aus einer einzelnen Person, errichteten wir eine Bibliothek mit einem DNA-Sequenzierung sequenziert. Diese Bibliotheken wurden hoch reproduzierbare und unvoreingenommene und eine Informatik-Analyse des sequenzierten lautet mit anderen H. Dujardini Genome zeigte eine minimale Menge an Verunreinigungen. Diese Methode kann auf unculturable Bärtierchen angewendet werden, die mit bisherigen Methoden nicht sequenziert werden könnte.

Introduction

Bärtierchen sind mikroskopisch kleine Tiere, die einen Ametabolic Staat namens Anhydrobiosis gegenüber Austrocknung eingeben können. Sie wiederherstellen, indem Sie die Absorption von Wasser1,2. Im Ametabolic Zustand sind Bärtierchen in der Lage, verschiedene extreme Umgebungen, die auch extremen Temperaturen3 und Druck4,5, eine hohe Dosierung von UV Licht6, Röntgenstrahlen und Gammastrahlen zu dulden 7 , 8und kosmischen Raum9. Genomdaten ist eine unabdingbare Grundlage für die Erforschung der molekularen Mechanismen der Anhydrobiosis.

Frühere Versuche, das Genom der Bärtierchen sequentiell zeigten Anzeichen einer bakteriellen Kontamination10,11,12,13,14. Genom-Sequenzierung von solchen kleinen Organismen erfordert eine große Anzahl von Tieren und ist anfällig für bakterielle Kontamination; Daher haben wir vorher eine Sequenzierung-Protokoll unter Verwendung einer Frequenzverschiebungen Eingabemethode, ausgehend von einem einzigen Exemplar der Bärtierchen, zur Minimierung des Risikos von Kontaminationen15etabliert. Mithilfe dieser Daten haben wir eine qualitativ hochwertige Neuanordnung und Remontage des Genoms von H. Dujardini16,17weiter durchgeführt. Hier beschreiben wir im Detail dieser Methode für die genomische Sequenzierung von tardigrade einzelnen ()Abbildung 1). Die Validierung dieser Sequenzierung Methode ist darüber hinaus im Mittelpunkt dieses Papiers und ist bereits in unserem vorherigen Bericht16gründlich diskutiert worden.

Diese Methode besteht aus zwei Teilen: die Isolation von einem einzigen Bärtierchen mit möglichst geringen Verunreinigungen und die qualitativ hochwertige Gewinnung von Piktogramm Ebenen der DNA. Die Bärtierchen ist verhungert und gründlich mit Wasser sowie Antibiotika gespült und beobachtet unter dem Mikroskop mit 500 X Vergrößerung um die Beseitigung der bakteriellen Verunreinigungen zu gewährleisten. Frühere Schätzungen und Messungen zeigen, dass ein einzelner Bärtierchen ca. 50-200 Pg genomische DNA-16, enthält, die durch das Chitin-Exoskelett knacken, durch Frost-Tau-wechseln oder durch manuelle Homogenisierung extrahiert wird. Diese genomische DNA ist Bibliotheksbau vorgelegt und auf einem Instrument DNA-Sequenzierung sequenziert. Eine zusätzliche Informatik-Analyse zeigt qualitativ hochwertige Sequenzierung sowie geringe Mengen an Verunreinigungen im Vergleich zu früheren tardigrade Sequenzierung Projekten.

Protocol

1. Vorbereitung Bereiten Sie 2 % Agarose-Gel mit destilliertem Wasser (DW) als Lösungsmittel in einer 90-mm-Kunststoff-Kulturschale und 10 mL einer 1 % Penicillin/Streptomycin cocktail mit DW. Das Gel kann 2-3 Wochen im Brutkasten gesetzt bei 18 ° c gelagert werdenHinweis: Vermeiden Sie jede Lagerung des Gels unter 10 ° C, für die niedrige Temperatur schrumpft Agarosegel, was in einem winzigen Spalt zwischen dem Gel und der Kultur Gericht Wand, in der die Bärtierchen gefangen werden können. …

Representative Results

Schadstoff-Ausschluss: Dieses Protokoll beinhaltet ein gründliches Waschen der Bärtierchen und eine Sterilisation mit Antibiotika-Behandlung um Kontamination zu minimieren. Dazu gehört auch eine visuelle Überprüfung um die Vollständigkeit dieser Prozesse sicherzustellen. Ein Mikroskopbild gemacht während der Validierung (Schritt 2.4 des Protokolls) ist in Abbildung 2dargestel…

Discussion

Bakterielle Kontamination stellt eine Bedrohung für die Genom-Sequenzierung von mikroskopischen Organismen. Während frühere Studien zu tardigrade Genomsequenzierung, Kontamination mit umfangreichen Informatik Methoden12,20herausgefiltert haben, sequenziert wir das Genom von einer einzelnen Person das Risiko von Kontaminationen zu minimieren. Da eine einzelne Bärtierchen enthält ungefähr 50-200 Pg genomische DNA16 und ist umhüllt von…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Nozomi Abe, Yuki Takai und Nahoko Ishii für ihre technische Unterstützung bei der Genom-Sequenzierung. Diese Arbeit wurde unterstützt von Beihilfe für die japanische Gesellschaft für Promotion of Science (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Beihilfe für junge Wissenschaftler (No.22681029) und KAKENHI Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (B), Nr. 17 H 03620 von JSPS, durch eine Zuschuss für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte der Sumitomo Foundation (No.140340) und andererseits durch Forschungsgelder von der Regierung der Präfektur Yamagata und Tsuruoka City, Japan. Chlorella Vulgaris verwendet, um die Bärtierchen ernähren wurde mit freundlicher Genehmigung von Chlorella Industry Co. LTD. zur Verfügung gestellt.

Materials

SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

References

  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
  4. Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
  5. Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
  6. Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
  7. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
  8. May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
  9. Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
  10. Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
  11. Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
  12. Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
  13. Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
  14. Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
  15. Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
  16. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
  17. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
  18. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
  19. Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
  20. Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
  21. Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
  24. Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).

Play Video

Cite This Article
Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

View Video