Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale
Summary
Forurening under den genomisk sekventering af mikroskopiske organismer er fortsat et stort problem. Her viser vi en metode til sequence genomet af et tardigrade fra et enkelt eksemplar med så lidt som 50 pg genomisk DNA uden hele genom forstærkning til at minimere risikoen for kontaminering.
Abstract
De er mikroskopiske dyr, som angiver en ametabolic stat kaldet anhydrobiosis når man står overfor udtørring og kan vende tilbage til deres oprindelige tilstand, når vand er leveret. Genomisk Sekventeringen af mikroskopiske dyr som Biogeografi risici bakteriel forurening, der nogle gange fører til fejlagtige fortolkninger, for eksempel med hensyn til omfanget af horisontal genoverførsel i disse dyr. Her, leverer vi en ultralow input metode for at sekvens genomet af tardigrade, Hypsibius dujardini, fra et enkelt eksemplar. Ved at ansætte grundig vask og forurenende udstødelse sammen med en effektiv udvinding af 50 ~ 200 pg genomisk DNA fra et enkelt individ, vi bygget et bibliotek sekventeret med en DNA-sekventering instrument. Disse biblioteker var meget reproducerbare og upartiske, og informatik analyse af den omkostningsstyring læser med andre H. dujardini genomer viste en minimal mængde af forurening. Denne metode kan anvendes til unculturable biogeografi, der ikke kunne blive sekventeret tidligere metoder.
Introduction
De er mikroskopiske dyr, der kan angive en ametabolic stat kaldet anhydrobiosis, når man står overfor udtørring. De inddrive ved absorption af vand1,2. I ametabolic staten er de i stand til at tolerere forskellige ekstreme miljøer, der omfatter ekstreme temperaturer3 og pres4,5, en høj dosis af ultraviolet lys6, røntgen og gammastråler 7 , 8, og kosmisk plads9. Genomisk data er et uundværligt grundlag for studiet af molekylære mekanismer af anhydrobiosis.
Tidligere forsøg på at sekvens Biogeografi genom har vist tegn på bakteriel forurening10,11,12,13,14. Genomisk sekventering af sådanne små organismer kræver et stort antal dyr og er liggende hen til bakteriel forurening; Derfor har vi tidligere fastsat en sekventering protokollen ved hjælp af en ultralow inddata metode med udgangspunkt i et enkelt eksemplar af tardigrade, for at minimere risikoen for forureninger15. Ved hjælp af disse data, har vi yderligere gennemført en høj kvalitet resequencing og gensamling af genomet af H. dujardini16,17. Her vi beskriver i detaljer denne metode for genomisk sekventering fra en enkelt tardigrade individuelle ()figur 1). Valideringen af denne sekventering metode er ud over fokus i dette papir og allerede er blevet grundigt drøftet i vores tidligere rapport16.
Denne metode består af to dele: isolering af en enkelt tardigrade med den laveste forurening mulige og høj kvalitet udvinding af piktogram niveauer af DNA. Tardigrade er udsultet og skylles grundigt med vand, som antibiotika og observeret under et mikroskop med 500 X forstørrelse at sikre fjernelse af enhver bakteriel forurening. Tidligere skøn og målinger viser, at et enkelt individ af tardigrade indeholder cirka 50-200 pg genomisk DNA16, som er udvundet af sprængning chitin exoskeleton af fryse-tø cykler eller ved manuel homogenisering. Denne genomisk DNA er indsendt til bibliotek opbygning og sekventeret på en DNA-sekventering instrument. En yderligere Informatik analyse viser høj kvalitet sekventering, samt lave niveauer for forurening i forhold til tidligere tardigrade sekventering projekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriel forurening udgør en trussel mod den genomisk sekventering af mikroskopiske organismer. Mens tidligere undersøgelser på tardigrade genome sequencing har filtreret ud forurening ved hjælp af omfattende Informatik metoder12,20, sekventeret vi genom fra en enkelt person til at minimere risikoen for kontaminering. Da en individuel tardigrade indeholder cirka 50-200 pg genomisk DNA16 og er indkapslet i et tykt lag af chitin exoskel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Nozomi Abe, Yuki Takai og Nahoko Ishii for deres tekniske support i genomisk sekvensering. Dette arbejde blev støttet af licensbetaling for Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP’ER) Research Fellow, KAKENHI licensbetaling for unge forskere (No.22681029) og KAKENHI licensbetaling for videnskabelig forskning (B), No. 17 H 03620 fra JSP’ER, ved en Tilskud til grundlæggende videnskab forskningsprojekter fra The Sumitomo Foundation (No.140340), og dels af forskningsmidler fra Yamagata Prefectural regering og Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris bruges til at fodre Biogeografi var som Chlorella Industry Co Ltd
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
