Ultralåga ingående Genome Sequencing bibliotek förberedelse från enda Tardigrade prov
Summary
Kontaminering under genomisk sekvensering av mikroskopiska organismer är fortfarande ett stort problem. Här visar vi en metod att sekvensera genomet hos en trögkrypare från ett enda exemplar med så lite som 50 pg av genomisk DNA utan hela genomet förstärkning för att minimera risken för kontaminering.
Abstract
Tardigrades är mikroskopiska djur som anger en ametabolic stat kallas anhydrobiosis inför uttorkning och kan återgå till sitt ursprungliga skick när vatten tillhandahålls. Genomisk sekvensering av mikroskopiska djur såsom tardigrades risker bakteriell kontamination som ibland leder till felaktiga tolkningar, till exempel angående omfattningen av horisontell genöverföring i dessa djur. Här ger vi en ultralåga inmatningsmetod för att sekvensera genomet hos trögkrypare, Echiniscus paret, från ett enda exemplar. Genom att anställa noggrann tvätt och föroreningars utslagning tillsammans med en effektiv utvinning av 50 ~ 200 pg genomiskt DNA från en enda individ, vi konstruerat ett bibliotek sekvenseras med ett instrument för DNA-sekvensering. Dessa bibliotek var mycket reproducerbara och opartisk, och en informatik analys av sekvenserade läser med andra H. paret genomen visade en minimal mängd av förorening. Denna metod kan tillämpas på unculturable tardigrades som inte kunde sekvenseras med föregående metoder.
Introduction
Tardigrades är mikroskopiska djur som kan ange en ametabolic stat kallas anhydrobiosis inför uttorkning. De återställa genom absorption av vatten1,2. I den ametabolic staten klarar tardigrades av att tolerera olika extrema miljöer, bland annat extrema temperaturer3 och tryck4,5, en hög dos av ultraviolett ljus6, röntgenstrålar och gammastrålar 7 , 8och kosmiska rymden9. Genomisk data utgör en oumbärlig grund för studier av molekylära mekanismer för anhydrobiosis.
Tidigare försök att sekvensera genomet hos tardigrades har visat tecken på bakteriell kontamination10,11,12,13,14. Genomisk sekvensering från sådana små organismer kräver ett stort antal djur och är benägna att bakteriell kontamination; Därför har vi tidigare konstaterat ett sekvensering protokoll med en ultralåga inmatningsmetod start från en enstaka exemplar av trögkrypare, för att minimera risken för föroreningar15. Med hjälp av dessa data, har vi ytterligare genomfört en högkvalitativ återställande och ihopsättning av genomet hos H. paret16,17. Här beskriver vi i detalj denna metod för genomisk sekvensering från en enda tardigrade individ ()figur 1). Validering av denna sekvensering metod är utöver fokus i denna uppsats och har redan diskuterats ingående i vårt föregående rapport16.
Denna metod består av två delar: isolering av en enda trögkrypare med den lägsta möjligt föroreningar och hög kvalitet extraktion av piktogram nivåer av DNA. Trögkrypare är utsvulten och sköljas grundligt med vatten, samt antibiotika och observerade under ett Mikroskop med 500 X förstoring för avlägsnande av någon bakteriell kontamination. Tidigare bedömningar och mätningar visar att en enda individ av trögkrypare innehåller ungefärligt 50-200 pg genomisk DNA16, som utvinns av sprickbildning Chitinen exoskelett genom frysning-tining cykler eller genom manuell homogenisering. Detta genomiskt DNA lämnas till biblioteket konstruktion och sekvenserade i ett instrument för DNA-sekvensering. En ytterligare informatik analys visar hög kvalitet sekvensering, samt låga halter av föroreningar jämfört med tidigare tardigrade sekvensering projekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriell kontaminering utgör ett hot mot genomisk sekvensering av mikroskopiska organismer. Medan tidigare studier på tardigrade Genomsekvensering har filtrerats bort kontaminering med omfattande informatik metoder12,20, sekvenserat vi genomet från en enda individ att minimera risken för föroreningar. Eftersom en enskild trögkrypare innehåller ungefärligt 50-200 pg genomisk DNA16 och är inkapslad i ett tjockt lager av chitinen e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Nozomi Abe, Yuki Takai och Nahoko Ishii för deras tekniska support i genomisk sekvensering. Detta arbete stöddes av bidrag för Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) Research Fellow, KAKENHI bidrag för unga forskare (No.22681029) och KAKENHI bidrag för vetenskaplig forskning (B), nr 17 H 03620 från JSPS, genom en Bidrag för grundläggande forskningsprojekt från Sumitomo Foundation (No.140340) och delvis av forskningsmedel från Yamagata prefekturernas regeringen och Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris används till foder på tardigrades var förutsatt artighet Chlorella Industry Co. LTD.
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
