전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

요약

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

초록

내 분 비 신호에 의해 기관 대 기관 통신 예를 들어 뇌에 주변에서은 항상성 유지 하기 위한 필수. 내 분 비 연구 모델 동물로, 초파리 melanogaster, 어떤은 정교한 유전자 도구 및 게놈 정보, 점점 사용 되고있다. 이 문서에는 초파리 뇌 explants의 칼슘 이미징 하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 직접 뇌에 호르몬의 신호 감지 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 많은 펩 티 드 호르몬 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs), 누구의 활성화 세포내 캘리포니아^{2 +}농도 있는 증가 일으키는 통해 행동. 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아^{2 +} 레벨을, 캘리포니아^{2 +} 유입 및 캘리포니아^{2 +} 바인딩과 그물 (ER)에 저장 된 자료를 올린다. 칼슘 센서, GCaMP, 이러한 Ca^{2 +} 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서는, GCaMP의, 신경에 표현 하 고 GCaMP을 표현 하는 애벌레 뇌를 해 부하 고 교양 비보 전. 테스트 펩 티 드 다음 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 GCaMP에 장착 된 CCD 카메라 회전 디스크 confocal 현미경을 사용 하 여 검색. 이 메서드를 사용 하 여 모든 수용 성 분자는 시험 될 수 있다, 그리고 신경 활성화와 관련 된 다양 한 셀룰러 이벤트 적절 한 형광 표시기를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 수정 하 여 이미지 다른 초파리 장기 나 다른 동물의 장기를이 메서드를 사용할 수 있습니다.

서론

기관 대 기관 통신 환경 변화에 대처 하기 위해 항상성 유지 하기 위한 진화론 보존된 전략 이다. 인간, 순환으로 내 분 비 동맥에서 호르몬 arereleased의 다양 한. 이러한 호르몬의 많은 신진 대사 과정 및^1,2먹이 등 기본적인 동작을 조절 하는 두뇌의 시상 하 부 대상. 많은 호르몬 포유류 모델을 사용 하 여 발견 되었습니다. 그러나, 그들의 행동, 특히 있는 그들이 참여, interorgan 네트워크의 메커니즘 크게 불분명 남아 있습니다.

초파리 melanogaster 기관 대 기관 통신 공부에 대 한 유용한 모델로 떠오르고 있다. 곤충, 많은 생리 적인 과정은 호르몬에 의해 제어 됩니다. 초기 연구 성장과 변형에 초점을 맞추고 큰 곤충을 사용. 이 연구에서 제거 또는 특정 장기의 이식 예측 간 장기 신호 분자;의 존재 나중에, 젊은 호르몬 (JH), Prothoracicotropic 호르몬 (PTTH), 및 Ecdysone 화학적 정화^3,,45....

프로토콜

1입니다. 애벌레 뇌 Explants의 준비

1. 이미징 챔버를 확인 합니다.
   참고: 안정적인 녹음 두뇌 explants 곁 수 있어야 합니다. 여기, 낮은-비용, 손으로 만든 이미징 챔버는 Ca^{2 +} 이미징 시스템에 사용 됩니다.
   1. 집게를 사용 하 여 쉽게 장착 (1.3, 그림 1단계)를 만드는 애벌레 두뇌의 복 부 신경 절에 대 한 덴트를 만드는 플라스틱 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 하단 중앙 스크래치.
   2. 이쑤시개와 덴트의 양쪽에 superglue의 작은 방울을 놓고 접착제를 텅스텐 막대 (0.125 m m, 6 ~ 7 m m 길이)를 연결 합니다.
   3. 퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 작은 조각을 사용 하 여, 확인 (10 m m 직경에서 및 높이 3 m m) 원형 벽 주변 덴트 (그림 1).
      참고: 벽 내부의 공간 나중으로 채워질 것 이다 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 0.14 M NaCl, KCl, 0.0027 M 0.01 M 포₄^3-, 25 ℃에서 pH 7.4 ± 0.05).
2. 동물 ....

결과

이 프로토콜을 사용 하는 펩 티 드 호르몬, CCHa2에 의해 뇌 인슐린 생산 세포 (IPCs)의 정품 인증 시험 되었다. 야생-타입 두뇌의 IPCs GCaMP6s로 표시 했다 dilp2-GAL4¹² (박사 Rulifson 선물), UAS-GCaMP6s¹³ (김 박사 선물)의 조합을 사용 하 여. 애벌레 두뇌 explants 합성 CCHa2 펩 티 드로 치료 했다 그리고 GCaMP6s에서 형광 실시간으로 기록 했다. 이 실험에서 이미지는 단일 초점 평면에서 얻은 했다. 각 IPC 클러스터 포함 약 14 셀¹⁴, 그리고 6 셀에 3에서 신호 감지 했다. GCaMP6s 신호 강도 CCHa2 행정 (그림 2영화 1) 극적으로 증가 되었.......

토론

캘리포니아^{2 +} 이미징 방법을 여기에 설명 된 뇌에서 호르몬의 기능을 테스트 하기 위한 유용한 시스템입니다. Vivo에서 두뇌 다양 일 분 비 장기에서 호르몬을 받습니다. 더하여, 두뇌는 끊임없이 자연 신경 활성화를 일으키는 원인이 되는 감각 정보를 오름차순 인식. 이 비보 전 시스템 같은 노이즈를 제거 하 고 vivo에서 영상 보다 더 나은 신호/잡음 비율을 생성 합니다. 이 시스템에 단독으로 또는 조합에서 분자를 테스트할 수 있습니다. 펩 티 드 호르몬 이외에 천연 또는 합성 화합물을 포함 하 여 모든 수용 성 분자는 두뇌 explant에 적용할 수 있습니다.

캘리포니아^{2 +} 이미징, 뇌 explants 곁에 있이 필요가 있다. 이 위해 젤 매트릭스 낮은 녹는 포인트 agarose 또는 섬유 소 되었습니다 사용 이전^16,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
텅스텐 막대	AM 시스템, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	퍼티와 같은 재사용 가능한 접착제
시계 유리, 사각형, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	인산염 완충염
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-V
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	형광 현미경
대물렌즈 W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	침수 대물 렌즈
P-725 PIFOC 대물 스캐너 장거리 이동 범위	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	압전 활성화 렌즈 무버
컨포칼 스캐너 유닛 CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	스피닝 디스크 컨포칼 헤드
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD 카메라
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm 레이저
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/ 38-25	방출 필터
&마이크로; Open	Imaging, Inc.	해당 없음	https://micro-manager.org
ImageJ	미국 국립보건원(National Institutes of Health)	해당 없음	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thé venaz, Biomediccal Imaging Group, 스위스 로잔 연방공과대학	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/

매니저