Summary

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Published: June 02, 2018
doi:

Summary

Este papel describe un protocolo para ex vivo calcio la proyección de imagen del cerebro de Drosophila . En este método, compuestos naturales o sintéticos pueden aplicarse en el búfer para poner a prueba su capacidad para activar las neuronas particular en el cerebro.

Abstract

Comunicación de órgano a órgano por la señalización endocrina, por ejemplo, de la periferia al cerebro, es esencial para mantener la homeostasis. Como un animal modelo para la investigación endocrina, Drosophila melanogaster, que cuenta con sofisticadas herramientas de genéticas y genoma información, se está utilizando cada vez más. Este artículo describe un método para la proyección de imagen de calcio de los explantes del cerebro de Drosophila . Este método permite la detección de la señalización directa de una hormona en el cerebro. Es bien sabido que muchas de las hormonas peptídicas actúan a través de G proteína-juntó los receptores (GPCRs), cuya activación provoca un aumento en la concentración de Ca2 +intracelular. Activación neural también eleva el Ca2 + los niveles intracelulares, de Ca2 + afluencia y la liberación de Ca2 + en el retículo endoplásmico (ER). Un sensor de calcio, GCaMP, puede controlar estos cambios de Ca2 + . En este método, GCaMP se expresa en las neuronas de interés, y el cerebro larvas GCaMP expresando es disecado y cultivado ex vivo. El péptido de la prueba se aplica a la explantación de cerebro, y los cambios fluorescentes en GCaMP se detectan utilizando un microscopio confocal de disco giratorio equipado con una cámara CCD. Usando este método, cualquier molécula soluble en agua puede ser probada, y varios eventos celulares asociados con la activación neural pueden ser reflejados mediante los indicadores fluorescentes apropiados. Por otra parte, mediante la modificación de la cámara de proyección de imagen, este método puede utilizarse para otros órganos de Drosophila o los órganos de otros animales de la imagen.

Introduction

Órgano de órgano de comunicación es una estrategia evolutivamente conservada para mantener la homeostasis para hacer frente a cambios ambientales. En los seres humanos, una variedad de arereleased de las hormonas de las glándulas endocrinas en la circulación. Muchas de estas hormonas objetivo el hipotálamo del cerebro, que regula los procesos metabólicos y conductas fundamentales como alimentación1,2. Se han descubierto muchas hormonas utilizando modelos de mamíferos. Sin embargo, los mecanismos de su acción, especialmente las redes interorgan en el que participan, siendo en gran parte confusos.

Drosophila melanogaster ha emergido como un modelo útil para estudiar la comunicación de órgano a órgano. En insectos, muchos procesos fisiológicos son controlados por hormonas. Los primeros estudios centrándose en el crecimiento y metamorfosis utilizan grandes insectos. En estos estudios, la extirpación o trasplante de órganos específicos predijo la existencia de moléculas de señalización entre órganos; más tarde, la ecdisona, la hormona juvenil (JH) y Prothoracicotropic hormona (PTTH) fueron purificada bioquímicamente3,4,5. Una gran familia de péptidos de señalización intercelulares se piensa para estar implicado en varios eventos fisiológicos durante el ciclo de vida de insectos6,7. La mayoría de estos péptidos actúa sobre G-proteína-juntó los receptores (GPCRs), aunque los GPCRs específicos fueron inicialmente difíciles de identificar utilizando métodos convencionales. La publicación de la Drosophila genoma secuencia8 fue el gran avance que permitió la identificación de péptidos bioactivos de Drosophila basado en su homología a las encontradas en otros insectos. Además, se identificaron los receptores para varios péptidos de GPCRs previstos en el genoma usando análisis de unión de ligando GPCR basada en cultivo celular. A continuación, análisis de expresión predijeron las vías de órgano a órgano sacadas por estos péptidos y receptores. En particular, muchos de los receptores de péptido putativo se expresan en el cerebro, lo que sugiere que el cerebro es un blanco importante de péptidos hormonas9. Por otra parte, las herramientas avanzadas de genéticas en Drosophila han contribuido a la identificación de roles fisiológicos de combinaciones de péptido GPCR. Por ejemplo, el GAL4 y sistemas binarios transcripcionales de LexA permiten knockdown de genes o sobreexpresión de forma espacial y temporal controlada. GAL4, un factor de la transcripción en levadura, se une a una secuencia específica de cis-regulador llamada secuencia de activación ascendente (UAS). En el sistema de GAL4/UAS, la línea del controlador proporciona tejidos específicos o expresión de GAL4 etapa-específica y la línea de respuesta lleva UAS corriente arriba del gen de interés o de la construcción en expresión de shRNAs en coche. LexA/LexAop sistema se basa en un mecanismo similar. Análisis fenotípicos de los animales de tejidos específicos péptido-caída y tejidos específicos GPCR-caída pueden revelar información sobre modo del GPCR péptido de señalización y sitio de acción. Sin embargo, las conclusiones que se pueden llegar únicamente por datos genéticos son limitadas. Por otra parte, una vez que el supuesto objetivo de una hormona peptídica particular es limitado a un tipo de tejido o célula, puede utilizarse para aclarar la comunicación de órgano a órgano mediada por péptidos GPCR signaling ex vivo calcio en explantes de órgano. La activación de un GPCR acoplado a Gq, se incrementa la concentración de Ca2 + intracelular debido a la liberación de Ca2 + de la ER10. En el cerebro, la activación neural también eleva los niveles de Ca2 + intracelulares. Tal Ca2 + aumenta puede detectarse mediante un sensor de calcio, GCaMP, que sufre cambios conformacionales en presencia de Ca2 + en fluorescencia emisión11.

En este artículo, se describe un calcio explantes método proyección de imagen del cerebro de Drosophila . Para probar la capacidad de un péptido para activar las neuronas específicas, un péptido de prueba se aplica al explante expresando su GCaMP cerebro, y cambios de fluorescencia son monitoreados mediante microscopía confocal. La participación de lo GPCR es confirmada luego por realizar el mismo análisis utilizando un cerebro mutante que carece el GPCR. Esta combinación de imágenes y genética proporciona información precisa acerca de órgano a órgano comunicación por péptidos-GPCRs. posibles modificaciones y aplicaciones de este protocolo también se discuten.

Protocol

1. preparación de los explantes de cerebro larvas Hacer una cámara de proyección de imagen.Nota: Grabación estable requiere que los explantes de cerebro ser atado. Aquí, se utiliza una cámara de bajo costo, hechas a mano en el Ca2 + sistema de imagen. Con unas pinzas, rayar el centro inferior de una placa de cultivo de plástico (35 x 10 mm) para crear un hueco para el ganglio ventral del cerebro larvas que hace más fácil montaje (paso 1.3, figura 1)….

Representative Results

Mediante este protocolo, la activación de la insulina produciendo las células del cerebro (IPCs) de la hormona del peptide, CCHa2, fue examinada. IPCs del cerebro de tipo salvaje fueron etiquetadas con GCaMP6s usando una combinación de dilp2 -GAL412 (un regalo del Dr. Rulifson) y UAS-GCaMP6s13 (un regalo del Dr. Kim). Explantes de cerebro larvas fueron tratados con un péptido sintético de CCHa2, y la fluorescencia de G…

Discussion

El Ca2 + imagen método descrito aquí es un sistema útil para probar la función de las hormonas en el cerebro. En vivo, el cerebro recibe las hormonas de diferentes órganos endocrinos. Además, el cerebro percibe constantemente ascendente la información sensorial, que provoca la activación neuronal espontánea. Este sistema ex vivo elimina dichos sonidos y produce una mejor relación señal/ruido que en vivo la proyección de imagen. En este sistema, las moléculas pueden anali…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones para la investigación científica (15 07147 K, 17K 07419) de JSP (a Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), una beca de investigación Fundación de Inamori (para HI) y el programa del centro de investigación uso común para la medicina del desarrollo, en el Instituto de embriología Molecular y genética, Universidad de Kumamoto (en HS). Agradecemos Dr. Azusa Kamikouchi y Sr. Daichi Yamada su ayuda para usar el sistema de proyección de imagen.

Materials

Tungsten rod A-M systems, Sequim, WA, USA 717000
Blu Tack Bostik, Paris, France 3049100 putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA 742300
PBS TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan T900 Phosphated buffered salts
CCHa2 SCRUM Inc., Tokyo, Japan Custum-synthesized peptide
Ghrerin Peptide institute Inc., Osaka, Japan 4372-s
Nociceptin Peptide institute Inc., Osaka, Japan 4313-v
Axio Imager A2 Carl Zeiss, Oberkochen, Germany Axio Imager A2 fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 Carl Zeiss, Oberkochen, Germany 420957-9900-000 water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany N/A piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1 Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan CSU-W1 spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13 Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan C9100-13 EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW Coherent, Santa Clara, CA, USA 1178770 488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter Semrock, Rochester, NY, USA Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock, Rochester, NY, USA FF01-528/38-25 emission filter
µManager Open Imaging, Inc. N/A https://micro-manager.org
ImageJ U. S. National Institutes of Health N/A https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne N/A http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/

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Cite This Article
Ishimoto, H., Sano, H. Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (136), e57701, doi:10.3791/57701 (2018).

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