전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Summary

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

Abstract

내 분 비 신호에 의해 기관 대 기관 통신 예를 들어 뇌에 주변에서은 항상성 유지 하기 위한 필수. 내 분 비 연구 모델 동물로, 초파리 melanogaster, 어떤은 정교한 유전자 도구 및 게놈 정보, 점점 사용 되고있다. 이 문서에는 초파리 뇌 explants의 칼슘 이미징 하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 직접 뇌에 호르몬의 신호 감지 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 많은 펩 티 드 호르몬 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs), 누구의 활성화 세포내 캘리포니아^{2 +}농도 있는 증가 일으키는 통해 행동. 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아^{2 +} 레벨을, 캘리포니아^{2 +} 유입 및 캘리포니아^{2 +} 바인딩과 그물 (ER)에 저장 된 자료를 올린다. 칼슘 센서, GCaMP, 이러한 Ca^{2 +} 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서는, GCaMP의, 신경에 표현 하 고 GCaMP을 표현 하는 애벌레 뇌를 해 부하 고 교양 비보 전. 테스트 펩 티 드 다음 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 GCaMP에 장착 된 CCD 카메라 회전 디스크 confocal 현미경을 사용 하 여 검색. 이 메서드를 사용 하 여 모든 수용 성 분자는 시험 될 수 있다, 그리고 신경 활성화와 관련 된 다양 한 셀룰러 이벤트 적절 한 형광 표시기를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 수정 하 여 이미지 다른 초파리 장기 나 다른 동물의 장기를이 메서드를 사용할 수 있습니다.

Introduction

기관 대 기관 통신 환경 변화에 대처 하기 위해 항상성 유지 하기 위한 진화론 보존된 전략 이다. 인간, 순환으로 내 분 비 동맥에서 호르몬 arereleased의 다양 한. 이러한 호르몬의 많은 신진 대사 과정 및^1,2먹이 등 기본적인 동작을 조절 하는 두뇌의 시상 하 부 대상. 많은 호르몬 포유류 모델을 사용 하 여 발견 되었습니다. 그러나, 그들의 행동, 특히 있는 그들이 참여, interorgan 네트워크의 메커니즘 크게 불분명 남아 있습니다.

초파리 melanogaster 기관 대 기관 통신 공부에 대 한 유용한 모델로 떠오르고 있다. 곤충, 많은 생리 적인 과정은 호르몬에 의해 제어 됩니다. 초기 연구 성장과 변형에 초점을 맞추고 큰 곤충을 사용. 이 연구에서 제거 또는 특정 장기의 이식 예측 간 장기 신호 분자;의 존재 나중에, 젊은 호르몬 (JH), Prothoracicotropic 호르몬 (PTTH), 및 Ecdysone 화학적 정화^3,,45했다. 세포 신호 펩 티 드의 큰 가족 곤충 라이프 사이클^6,7동안 다양 한 생리 적 행사에 참여 하 생각 된다. 이러한 펩 티이 드의 대부분 비록 특정 GPCRs 처음 전통적인 방법을 사용 하 여 식별 하기 어려운 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)에서 작동 합니다. 초파리 전체 게놈 순서⁸ 의 간행물이 이었다 초파리 생리 활성 펩 티 드는 다른 곤충에서 발견 된에 그들의 상 동에 따라 식별을 사용 하는 획기적인. 또한, 여러 가지 펩 티 드에 대 한 수용 체는 GPCRs GPCR 리간드 바인딩 분석 셀-문화-기반을 사용 하 여 게놈에 예측에서 확인 되었다. 다음, 식 분석 예측 기관 대 기관 경로 이러한 펩 티 드와 수용 체에 의해 elicited. 특히, 상 상속 펩 티 드 수용 체의 많은 두뇌, 두뇌 펩 티 드 호르몬⁹의 주요 목표는 제안 표현 됩니다. 또한, 초파리 에서 유전자 고급 도구 펩 티 드 GPCR 조합의 생리 적 역할의 id에 공헌 했다. 예를 들어, GAL4 및 LexA 기반 이진 transcriptional 시스템 활성화 유전자 최저 또는 overexpression 공간 및 일시적으로 제어 방식. GAL4, 효 모에서 확인 된 녹음 방송 요인 특정 cis 규제 시퀀스 라는 상류 활성화 순서 (UAS)에 바인딩합니다. GAL4/UAS 시스템에서 드라이버 라인 제공 조직 관련 또는 단계 특정 GAL4 표현과 응답자 선 관심 또는 드라이브 shRNA 식 구조 유전자의 상류 UAS 운반. LexA/LexAop 시스템 비슷한 메커니즘을 기반으로 합니다. 조직의 특정 펩 티 드-최저와 조직 특정 GPCR 최저 동물의 phenotypic 분석 펩 티 드 GPCR 신호 모드와 행동의 사이트에 대 한 정보를 알아낼 수 있습니다. 그러나, 유전자 데이터에 의해서만 도달 될 수 있는 결론 제한 됩니다. 다른 한편으로, 특정 펩 티 드 호르몬의 상 상속 대상 조직 또는 세포 유형으로 좁혀입니다, 일단 비보 전 칼슘 기관 explants 이미징 펩 티 드 GPCR 신호에 의해 중재 기관 대 기관 통신 명료 하 사용할 수 있습니다. Gq 결합 GPCR의 활성화, 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도¹⁰응급실 캘리포니아^{2 +} 의 출시로 인해 증가 된다. 뇌, 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아^{2 +} 레벨을 올린다. 이러한 Ca^{2 +} 증가 칼슘 센서, GCaMP, 캘리포니아^{2 +} 형광 방출¹¹결과의 구조적 변화를 겪 습에 의해 감지할 수 있습니다.

이 문서에서는, 초파리 뇌를 사용 하 여 이미징 방법 explants 칼슘 설명 되어 있습니다. 특정 뉴런을 활성화 하는 펩 티 드의 능력을 테스트 하기 위해 테스트 펩 티 드 GCaMP 표현 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 confocal 현미경 검사 법에 의해 모니터링 됩니다. GPCR의 참여는 GPCR 부족 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 동일한 분석 결과 수행 하 여 다음 확인 된다. 이미징 및 유전학의이 조합은 펩 티 드에 의해 기관 대 기관 통신에 대 한 정확한 정보를 제공 합니다-GPCRs. 가능 수정 및이 프로토콜의 응용 프로그램 또한 토론 된다.

Protocol

1입니다. 애벌레 뇌 Explants의 준비 이미징 챔버를 확인 합니다.참고: 안정적인 녹음 두뇌 explants 곁 수 있어야 합니다. 여기, 낮은-비용, 손으로 만든 이미징 챔버는 Ca2 + 이미징 시스템에 사용 됩니다. 집게를 사용 하 여 쉽게 장착 (1.3, 그림 1단계)를 만드는 애벌레 두뇌의 복 부 신경 절에 대 한 덴트를 만드는 플라스틱 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 하단 ?…

Representative Results

이 프로토콜을 사용 하는 펩 티 드 호르몬, CCHa2에 의해 뇌 인슐린 생산 세포 (IPCs)의 정품 인증 시험 되었다. 야생-타입 두뇌의 IPCs GCaMP6s로 표시 했다 dilp2-GAL412 (박사 Rulifson 선물), UAS-GCaMP6s13 (김 박사 선물)의 조합을 사용 하 여. 애벌레 두뇌 explants 합성 CCHa2 펩 티 드로 치료 했다 그리고 GCaMP6s에서 형광 실시간으로 기록 했다…

Discussion

캘리포니아^{2 +} 이미징 방법을 여기에 설명 된 뇌에서 호르몬의 기능을 테스트 하기 위한 유용한 시스템입니다. Vivo에서 두뇌 다양 일 분 비 장기에서 호르몬을 받습니다. 더하여, 두뇌는 끊임없이 자연 신경 활성화를 일으키는 원인이 되는 감각 정보를 오름차순 인식. 이 비보 전 시스템 같은 노이즈를 제거 하 고 vivo에서 영상 보다 더 나은 신호/잡음 비율을 생성 합니?…

Materials

Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/