前体钙成像用于可视化大脑对果蝇内分泌信号的反应
Summary
本文介绍了 果蝇脑的体外钙成像协议。在这种方法中, 自然或合成化合物可以应用到缓冲, 以测试他们的能力, 激活特定神经元的大脑。
Abstract
通过内分泌信号, 例如从外围到大脑, 器官对器官的传播对于维持稳态是必不可少的。作为内分泌研究的动物模型, 具有成熟基因工具和基因组信息的果蝇正在越来越多地被使用。本文介绍了一种用于果蝇脑外植体的钙成像方法。这种方法能够检测到大脑中荷尔蒙的直接信号。众所周知, 许多肽荷尔蒙通过 G 蛋白偶联受体 (受体) 作用, 其活化导致胞内 Ca2 +浓度增加。神经激活还提升了胞内 ca2 +级别, 从 ca2 +的流入和释放 ca2 +存储在内质网 (ER)。钙传感器 GCaMP 可以监视这些 Ca2 +的更改。在该方法中, GCaMP 表达在感兴趣的神经元中, GCaMP 表达的幼虫脑被解剖和培养为前体.然后将试验肽应用于脑外植体, 用装有 CCD 摄像机的旋转圆盘共焦显微镜检测 GCaMP 的荧光变化。使用这种方法, 任何水溶性分子都可以进行测试, 与神经活化相关的各种细胞事件可以使用适当的荧光指示器进行成像。此外, 通过修改成像室, 该方法可用于图像其他果蝇器官或其他动物的器官。
Introduction
器官对器官的沟通是一种进化保守的策略, 用于维持动态平衡以应对环境变化。在人类中, 各种激素 arereleased 从内分泌腺体进入循环。许多这些荷尔蒙的目标是大脑的下丘脑, 它调节新陈代谢过程和基本行为, 如喂养1,2。许多荷尔蒙是用哺乳动物模型发现的。然而, 它们的行动机制, 特别是他们参与的 interorgan 网络, 在很大程度上仍然不清楚。
果蝇已成为研究器官与器官沟通的有用模型。在昆虫中, 许多生理过程是由荷尔蒙控制的。早期研究侧重于生长和变形使用大昆虫。在这些研究中, 特定器官的移除或移植预测了器官间信号分子的存在;后来, 青少年激素 (JH), Prothoracicotropic 激素 (PTTH) 和昆虫蜕皮激素生化纯化3, 4, 5.在昆虫生命周期的6、7中, 大量的细胞间信号肽被认为涉及各种生理事件。大多数这些肽作用于 G 蛋白偶联受体 (受体), 虽然特定的受体最初难以识别使用常规方法。果蝇全基因组序列8的发布是一个突破, 它使果蝇生物活性肽的鉴定与其他昆虫的同源性有关。此外, 用细胞培养为基础的 GPCR 配体结合试验, 从基因组预测的受体中发现了几种多肽受体。其次, 表达分析预测这些肽和受体诱发的器官对器官通路。值得注意的是, 许多假定的肽受体在大脑中表达, 这表明大脑是肽类激素的主要目标9。此外, 在果蝇中, 先进的基因工具有助于鉴定肽 GPCR 组合的生理作用。例如, 基于 GAL4 和莱克萨的二进制转录系统可以在空间和世俗控制的方式下使基因击倒或过度表达。GAL4 是酵母中识别的转录因子, 它与一种称为上游活化序列的特定顺规序列结合在一起。在 GAL4/UAS 系统中, 驱动程序行提供了组织特定的或特定于阶段的 GAL4 表达式, 而应答器线携带感兴趣的基因或构造来驱动 shRNA 表达式的无人机上游。莱克萨/LexAop 系统基于类似的机制。表型分析的组织特异性肽击倒和组织特异性 GPCR 的动物可以揭示的信息, 肽 GPCR 信号的模式和行动地点。然而, 仅仅通过遗传数据就可以得出的结论是有限的。另一方面, 一旦特定肽类激素的假定目标被缩小到组织或细胞类型, 在器官外植体中的活体钙成像可以用来阐明由肽 GPCR 信号介导的器官对器官的传播。在 Gq 耦合的 GPCR 激活后, 由于从 ER10释放 ca2 + , 胞内 ca2 +浓度增加。在大脑中, 神经激活还提升了胞内 Ca2 +级。此类 Ca2 +的增加可以通过钙传感器检测, GCaMP 在 Ca2 +的存在下发生构象变化, 导致荧光发射11。
本文介绍了一种使用果蝇脑外植体的钙成像方法。为了测试多肽激活特定神经元的能力, 将测试肽应用于 GCaMP 表达的脑外植体, 并通过共聚焦显微镜对荧光变化进行监测。GPCR 的参与, 然后确认通过执行相同的化验, 使用突变的大脑缺乏 GPCR。这种成像和遗传学的结合提供了关于多肽受体的器官与器官通讯的精确信息. 还讨论了此协议的可能修改和应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的 Ca2 +成像方法是一种用于测试大脑中荷尔蒙功能的有用系统。在体内,大脑接收来自各种内分泌器官的荷尔蒙。此外, 大脑不断感知上升的感官信息, 这会导致自发的神经元活化。此前体系统消除了此类噪音, 并产生了比体内成像更好的信号/噪声比。在这个系统中, 分子可以单独或组合测试。除了肽荷尔蒙, 任何水溶性分子, 包括天然或合成化合物, 都可以应用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了来自 jsp (15K07147、17K07419)、佐野基金会研究补助金 (HI) 和发展医学联合使用/研究中心 (Ishimoto) 的援助资助, 在熊本大学分子胚胎学与遗传学研究所 (HS)。我们感谢梓 Kamikouchi 博士和山田 Daichi 先生在使用成像系统方面的帮助。
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
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