Ex Vivo Imagerie calcique pour visualiser le cerveau réponses à signalisation endocrinienne chez la drosophile
Summary
Cet article décrit un protocole pour ex vivo imagerie calcique du cerveau drosophile . Dans cette méthode, des composés naturels ou synthétiques peuvent être appliqués à la mémoire tampon pour tester leur capacité à activer les neurones particulières dans le cerveau.
Abstract
Orgue-de communication par la signalisation endocrinienne, par exemple, de la périphérie vers le cerveau, est essentielle au maintien de l’homéostasie. Comme un animal modèle pour la recherche endocrinienne, Drosophila melanogaster, qui a sophistiqué outils génétiques et l’information de génome, est plus en plus utilisé. Cet article décrit une méthode pour l’imagerie calcique des explants de cerveau de drosophile . Cette méthode permet la détection de la signalisation directe d’une hormone dans le cerveau. Il est bien connu que beaucoup d’hormones peptidiques agissent par l’intermédiaire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), dont l’activation entraîne une augmentation de la concentration intracellulaire du Ca2 +. Activation neurale élève aussiCa 2 + intracellulaire, de l’influx de Ca2 + et de la libération de Ca2 + stocké dans le réticulum endoplasmique (re). Un capteur de calcium, GCaMP, permet de surveiller ces changements de Ca2 + . Dans cette méthode, GCaMP est exprimé dans les neurones d’intérêt, et le cerveau larvaire exprimant le GCaMP est disséqué et cultivé ex vivo. Le peptide de test est ensuite appliqué à l’explant de cerveau, et les changements fluorescents dans GCaMP sont détectés à l’aide d’un microscope confocal de rotation disque équipé d’une caméra CCD. En utilisant cette méthode, n’importe quelle molécule soluble dans l’eau peut être testée, et divers événements cellulaires associés à l’activation neuronale peuvent être photographiées en utilisant les indicateurs fluorescents appropriés. En outre, en modifiant la chambre d’imagerie, cette méthode peut servir à l’image des autres organes de la drosophile ou les organes d’autres animaux.
Introduction
Orgue-de communication est une stratégie évolutivement conservée pour le maintien de l’homéostasie pour faire face aux changements environnementaux. Chez l’homme, une variété d’arereleased hormones des glandes endocrines dans la circulation. Beaucoup de ces hormones ciblent l’hypothalamus du cerveau, qui régit les processus métaboliques et des comportements fondamentaux tels que l’alimentation1,2. Beaucoup d’hormones ont été découverts à l’aide de modèles mammifères. Cependant, les mécanismes de leur action, en particulier les réseaux proposé auxquelles ils participent, demeurent en grande partie incertains.
Drosophila melanogaster est devenue un modèle utile pour étudier l’orgue au grand orgue communication. Chez les insectes, de nombreux processus physiologiques sont contrôlés par les hormones. Les premières études axées sur la croissance et métamorphose utilisé de gros insectes. Dans ces études, l’enlèvement ou la transplantation d’organes spécifiques avait prédit l’existence de molécules de signalisation inter orgues ; plus tard, l’hormone juvénile (JH), prothoracicotropique hormone (PTTH) et Ecdysone sont biochimiquement purifiée3,4,5. Une grande famille de peptides de signalisation intercellulaires est censée participer à diverses manifestations physiologiques durant le cycle de vie insectes6,7. La plupart de ces peptides agit sur les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), bien que les RCPG spécifiques ont été initialement difficile à identifier à l’aide de méthodes conventionnelles. La publication de la drosophile de séquence du génome entier8 a été la percée qui a permis l’identification de peptides bioactifs de Drosophila basé sur leur homologie à celles retrouvées chez d’autres insectes. En outre, les récepteurs de plusieurs peptides ont été identifiés des RCPG prévues dans le génome à l’aide de la culture-RCPG-ligand binding analyses cellulaires. Ensuite, analyses d’expression prédit les voies à-orgue induites par ces peptides et récepteurs. En particulier, beaucoup des récepteurs putatifs de peptide sont exprimés dans le cerveau, ce qui suggère que le cerveau est une cible majeure du peptide hormones9. En outre, les outils avancés de génétiques chez la drosophile ont contribué à l’identification des rôles physiologiques de combinaisons de peptide-RCPG. Par exemple, les systèmes transcriptionnelles binaires LexA et GAL4 permettent de gène ou la surexpression d’une manière contrôlée dans le temps et l’espace. GAL4, un facteur de transcription identifié chez la levure, se lie à une séquence de cis-réglementation spécifique appelée séquence d’Activation en amont (SAMU). Dans le système de GAL4/UAS, la ligne pilote fournit des tissus-spécifiques ou expression de GAL4 stade spécifique et la ligne de répondeur porte SAMU en amont du gène d’intérêt ou de la construction à l’expression de shARN en voiture. LexA/LexAop système repose sur un mécanisme similaire. Analyse phénotypique des animaux de tissu-spécifique tissu-spécifique et de peptide-choc de GPCR-knockdown peut révéler des informations sur le mode de signalisation le peptide-RCPG et site d’action. Toutefois, les conclusions qui sont accessibles uniquement par les données génétiques sont limitées. En revanche, une fois que la cible présumée d’une hormone peptidique particulière est réduite à un type de cellule ou de tissu, ex vivo calcium d’imagerie des explants orgue peut servir à élucider l’orgue-à communication médiée par le peptide-GPCR signalisation. Moment de l’activation d’un RCPG Gq couplées, la concentration intracellulaire de Ca2 + est augmentée en raison de la libération de Ca2 + de l’ ER10. Dans le cerveau, activation neurale augmente également le taux intracellulaire de Ca2 + . Ces augmentations de Ca2 + peuvent être détectées par un capteur de calcium, GCaMP, qui subit des changements conformationnels en présence de Ca2 + résultant en fluorescence d’émission11.
Dans cet article, un méthode d’imagerie à l’aide de Drosophila cerveau des explants de calcium est décrite. Pour tester la capacité d’un peptide à activer les neurones spécifiques, un peptide de test est appliqué à l’explant exprimant le GCaMP de cerveau, et les changements de fluorescence sont surveillés par microscopie confocale. L’implication de la GRCP est ensuite confirmée en effectuant la même épreuve en utilisant un mutant cerveau manque le RCPG. Cette combinaison de génétique et d’imagerie fournit des informations précises sur l’orgue au grand orgue communication en peptides-RCPG. Possible modifications et les applications du présent protocole sont également discutées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le Ca2 + imagerie méthode décrite ici est un système utile pour tester le fonctionnement des hormones dans le cerveau. In vivo, le cerveau reçoit des hormones de divers organes endocriniens. En outre, le cerveau perçoit sans cesse croissant d’informations sensorielles, qui entraîne l’activation neuronale spontanée. Ce système ex vivo élimine ces bruits et donne un meilleur rapport signal/bruit que l’imagerie in vivo . Dans ce système, les molécules peuvent être test…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été pris en charge par des subventions pour la recherche scientifique (15K 07147, 17K 07419) de pages JSP (pour Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), une subvention de recherche de la Fondation Inamori (sur HI) et le programme commun Usage/Centre de recherche pour Developmental Medicine, à l’Institut d’embryologie moléculaire et génétique, Université de Kumamoto (a HS). Nous remercions le Dr Azusa Kamikouchi et M. Daichi Yamada pour leur aide dans l’utilisation du système d’imagerie.
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
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