Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre

Summary

En vrac gene expression mesures nuage cellule individuelle différences dans les populations de cellules hétérogènes. Nous décrivons ici un protocole pour analyse de l’expression génique et l’index Comment unicellulaires Tri par Florescence activé cellule Tri (FACS) peut être combiné pour délimiter l’hétérogénéité et immunophenotypically caractériser les populations cellulaires moléculairement distinctes.

Abstract

Immunophénotypiques caractérisation et analyse moléculaire ont longtemps servis à délimiter l’hétérogénéité et de définir les populations cellulaires distincts. FACS est en soi un dosage unicellulaires, toutefois avant l’analyse moléculaire, les cellules cibles sont souvent prospectivement isolées en vrac, perdant ainsi la résolution unicellulaire. Analyse de l’expression génique de la cellule unique fournit un moyen de comprendre les différences moléculaires entre les cellules individuelles dans les populations de cellules hétérogènes. Dans l’analyse de cellules en vrac une surreprésentation d’un type de cellules distinctes donne les préjugés et les occlusions des signaux des cellules rares avec importance biologique. En utilisant FACS indice tri couplé à l’analyse de l’expression génique de la cellule unique, les populations peuvent être étudiées sans la perte de résolution unicellulaire, tandis que les cellules avec l’expression de marqueurs de surface de cellules intermédiaires sont également capturés, permettant l’évaluation de la pertinence de l’expression du marqueur de surface continue. Nous décrivons ici une approche qui combine monocellulaires transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) et FACS index tri afin de caractériser simultanément le moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité au sein de populations de cellules.

Contrairement aux méthodes de séquençage de l’ARN unicellulaire, l’utilisation de qPCR avec l’amplification de la cible spécifique permet des mesures robustes des transcriptions de faible abondance avec moins d’abandons, alors qu’il n’est pas confondue par les questions liées aux variations de cellule-à lire profondeur. En outre, par directement tri indice unique-cellules en lysis buffer cette méthode, permet pour la synthèse de cDNA et préamplification cible spécifique à effectuer en une seule étape, aussi bien en ce qui concerne la corrélation des signatures moléculaires dérivés par la suite avec la surface de la cellule expression du marqueur. L’approche décrite a été développé pour enquêter sur le single-cellules hématopoïétiques, mais ont aussi été utilisées avec succès sur d’autres types de cellules.

En conclusion, l’approche décrite ci-après permet de mesurer sensible d’expression de l’ARNm pour un groupe de gènes présélectionnés avec la possibilité d’élaborer des protocoles d’isolement éventuels ultérieur de sous-populations moléculairement distinctes.

Introduction

Chaque cellule individuelle de sang est censé résider dans une hiérarchie cellulaire, où les cellules souches forment l’apex au sommet d’une série de plus en plus engagés progéniteurs intermédiaires qui différencient finalement en phase terminale dans les cellules effectrices final porteurs spécifiques fonctions biologiques¹. Une grande partie de la connaissance au sujet de comment sont organisés les systèmes de cellules souches a été générée dans le système hématopoïétique, principalement en raison de la capacité d’isoler prospectivement des populations distinctes de hématopoïétiques hautement enrichies pour les cellules souches ou cellules souches diverses² par un tri de FACS. Cela a permis à bon nombre de ces populations à analyser sur le plan fonctionnel ou moléculairement, principalement à travers l’expression de gènes^3,4. Toutefois lorsque analyser l’expression des gènes de la majeure partie des populations des différences individuelles entre les cellules sont en moyenne et perdu⁵. Ainsi, l’incapacité à détecter les variations de la cellule-cellule au sein des fractions cellulaires hétérogènes peut-être entraîner notre compréhension des processus biologiques critiques si petits sous-ensembles des cellules responsables de la fonction biologique inférée de cette population^{6, 7}. À l’inverse, enquête des signatures d’expression génique à cellule unique résolution offrent une possibilité de délimiter l’hétérogénéité et contourner les influences éclipsa surreprésentés sous-ensembles de cellules⁸.

À ce jour de nombreux protocoles pour l’analyse de l’expression génique de la cellule unique ont été développées ; avec chaque approche ayant ses propres réserves. La première méthode était RNA Fluorescent in situ hybridation (RNA-poisson), qui mesure un nombre limité de relevés de notes à la fois, mais est unique parce qu’elle permet pour enquête de RNA localization^9,11. Méthodes précoces à l’aide de la PCR et qPCR pour détecter qu’un seul ou quelques transcriptions ont été également mis au point¹². Cependant, ils ont dernièrement été remplacés par des méthodes axées sur la microfluidique qui peuvent analyser simultanément l’expression de centaines de transcriptions par cellule chez des centaines de cellules par l’intermédiaire de qPCR et ainsi permettre d’hétérogénéité de grande dimension à l’aide de l’analyse prédéterminé gène panneaux^10,13. Récemment technologies basées sur le séquençage de RNA ont devenu employé couramment pour analyse unicellulaires, puisque ceux-ci peuvent théoriquement mesurer le transcriptome entier d’une cellule et ainsi ajouter une dimension exploratoire à l’hétérogénéité analyse^{10, 14}. multiplexé qPCR analyse et le séquençage de RNA unicellulaires ont des caractéristiques différentes, la justification de l’utilisation de méthodes dépend donc de la question posée ainsi que le nombre de cellules dans la population cible. Le haut débit et à faible coût par cellule ainsi que des caractéristiques non biaisées, exploratoires du séquençage de RNA unicellulaires sont souhaitables lorsque cellule inconnue ou grandes populations ont été étudiées. Cependant, séquençage RNA unicellulaire est également biaisé en faveur de séquençage hautes transcriptions abondantes plus fréquemment tandis que les relevés de notes peu abondantes sont sujettes aux décrocheurs. Cela peut conduire à des données beaucoup complexes qui met haute-exigences sur l’analyse bioinformatique pour révéler les signaux moléculaires importants qui sont souvent subtiles ou masqués en bruit technique¹⁵. Ainsi, pour tissus bien caractérisés, monocellulaires qPCR analyse utilisant prédéterminé panneaux amorces sélectionnées pour fonctionnellement importants gènes ou marqueurs moléculaires peut servir d’une approche sensible, simple pour déterminer l’hétérogénéité d’un population. Toutefois, il est à noter que par rapport à cellule unique RNA-seq, le coût par cellule est généralement plus élevé pour les méthodes qPCR unicellulaires. Nous décrivons ici une approche qui combine single-cell RT-qPCR (modifié d’après J. Teles et al. ( ¹⁶), à l’index de FACS tri simultanément les¹⁷ et bioinformatique analyse¹⁸ afin de caractériser l’hétérogénéité moléculaire et immunophénotypiques au sein des populations.

Dans cette approche, la population de cellules d’intérêt est tachée et single-cellules sont triés par FACS directement dans le tampon de lyse en plaques PCR 96 puits. Simultanément, les niveaux d’expression d’un ensemble de marqueurs de surface cellulaire supplémentaires sont comptabilisés pour chaque cellule unique pendant FACS-tri, une méthode qui est appelée indice de tri. Le matériau à cellules lysées est amplifié par la suite et l’expression de gène d’un ensemble sélectionné de gènes analysés avec la RT-qPCR, utilisant une plate-forme microfluidique. Cette stratégie permet une analyse moléculaire de la caractérisation de cellule unique mais aussi simultanée triée d’expression de marqueurs de surface cellulaire de chaque cellule individuelle. En mappant directement des sous-ensembles moléculairement distinctes des cellules à l’expression des marqueurs triés indexées, les sous-populations peuvent être liées à une immunophenotype spécifique qui peut être utilisé pour leur isolement éventuels. La méthode est décrite étape par étape dans la Figure 1. Outre une Comité pré-déterminé gène contribue à une résolution plus élevée de l’expression du gène ciblé, car il contourne la mesure de non pertinents gènes abondantes qui peuvent autrement occlure des signaux d’expression génique subtile. De plus, l’amplification de la cible spécifique, transcription inverse une étape et amplification permet de mesurer robuste de faibles transcriptions exprimées, comme des facteurs de transcription ou non-poly-adenylated ARN. Ce qui est important, les méthodes de qPCR permettent pour la mesure des ARNm des protéines de fusion, qui sont importants dans les enquêtes sur certaines maladies malignes¹⁹. Enfin, le nombre ciblé des gènes étudiés, faibles taux d’abandon, et limité les différences techniques entre les cellules font cette méthode facilement analysée par rapport aux méthodes dimensionnelles plus élevées, comme unicellulaires RNA-Seq. En suivant le protocole, une expérience entière peut être effectuée, du tri des cellules aux résultats analysés, dans les trois jours, ce qui en fait une méthode simple et rapide pour l’analyse d’expression génique de cellules individuelles sensibles et à haut débit.

Protocol

1. préparation des plaques de lyse À l’aide d’un banc libre ARN/ADN, préparer suffisamment tampon de lyse à 96 puits, avec 10 % de bonus, en mélangeant l’eau libre nucléase µL 390, 17 µL de 10 % NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT et inhibiteur de RNAse 5,3 µL (voir Table des matières). Vortex et la centrifuger. Distribuer 4 µL de tampon de lyse dans chaque puits d’une plaque de PCR 96 puits et les plaques avec du film adhésif d’étanchéité. Tournez en …

Representative Results

Le protocole décrit est rapide, facilement exécutées et très fiable. Un aperçu de la mise en place expérimentale est présenté dans la Figure 1. L’ensemble du protocole, du tri de simples cellules, amplification de la cible spécifique, mesures d’expression de gène et analyse préliminaire peut être effectué en trois jours. Un exemple des résultats analysés sous la forme d’une carte de chaleur qui représente ont analysé les données préli…

Discussion

Ces dernières années, analyse de l’expression génique de la cellule unique est devenu un atout précieux pour définir l’hétérogénéité des différentes cellules populations²³. L’avènement des technologies de séquençage de RNA offre théoriquement une possibilité permettant de mesurer le transcriptome entier d’une cellule, cependant ces méthodes sont compliquées par des variations de profondeurs de séquençage de cellule-cellule et abandons. Unicellulaire qPCR offre une analy…

Materials

CD14 PECY5	eBioscience	15-0149-42	Clone: 61D3
CD16 PECY5	Biolegend	302010	Clone: 3G8
CD56 PECY5	Biolegend	304608	Clone: MEM-188
CD19 PECY5	Biolegend	302210	Clone: HIB19
CD2 PECY5	Biolegend	300210	Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5	Biolegend	300310	Clone: HIT3a
CD123 PECY5	Biolegend	306008	Clone: 6H6
CD235A PECY5	BD Pharma	559944	Clone GAR2
CD34 FITC	Biolegend	343604	Clone: 561
CD38 APC	Biolegend	303510	Clone: Hit2
CD90 PE	Biolegend	328110	Clone: 5E10
CD45RA BV421	BD bioscience	560362	Clone: HI100
CD49f Pecy7	eBioscience	25-0495-82	Clone: eBioGOH3
FBS	HyClone	SV30160.3
PBS	HyClone	SH30028.02
96-well u-bottom Plate	VWR	10861-564
SFEM	Stem cell technologies	9650
Penicillin streptomycin	HyClone	SV30010
TPO	Peprotech	300-18
SCF	Peprotech	300-07
FLT3L	Peprotech	300-19
Falcon Tube 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Eppendorph tube	Sarstedt	72.690.001
CST beads	BD	642412
Accudrop Beads	BD	345249	6-µm particles
Adhesive film Clear	Thermo scientific	AB-1170
Adhesive film Foil	Thermo scientific	AB-0626
96 well PCR plate	Axygen	PCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tube	Axygen	MCT-150-L-C
T100 PCR cycler	BioRad	186-1096
10% NP40	Thermo scientific	85124
10mM dNTP	Takara	4030
0.1M DTT	Invitrogen	P2325
RNAsout	Invitrogen	10777-019	RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen	11753-100
Neuclease free water	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
2X Reaction Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966026
TaqMan Cells-to-CT Control Kit	Invitrogen	4386995
Xeno RNA Control	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs	Fluidigm	BMK-M10-96.96
2X Assay Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
20X GE Sample Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016
BioMark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96GT
Excel	Microsoft	Microsoft
FlowJo V10	TreeStar	TreeStar
Fluidigm real time PCR analysis	Fluidigm	Fluidigm
CD179a.VPREB1	Thermofisher scientific	Hs00356766_g1
ACE	Thermofisher scientific	Hs00174179_m1
AHR	Thermofisher scientific	Hs00169233_m1
BCR_ABL.52	Thermofisher scientific	Hs03043652_ft
BCR_ABL41	Thermofisher scientific	Hs03024541_ft
BMI1	Thermofisher scientific	Hs00995536_m1
CCNA2	Thermofisher scientific	Hs00996788_m1
CCNB1	Thermofisher scientific	Hs01030099_m1
CCNB2	Thermofisher scientific	Hs01084593_g1
CCNC	Thermofisher scientific	Hs01029304_m1
CCNE1	Thermofisher scientific	Hs01026535_g1
CCNF	Thermofisher scientific	Hs00171049_m1
CCR9	Thermofisher scientific	Hs01890924_s1
CD10.MME	Thermofisher scientific	Hs00153510_m1
CD11a	Thermofisher scientific	Hs00158218_m1
CD11c.ITAX	Thermofisher scientific	Hs00174217_m1
CD123.IL3RA	Thermofisher scientific	Hs00608141_m1
CD133.PROM1	Thermofisher scientific	Hs01009250_m1
CD151	Thermofisher scientific	Hs00911635_g1
CD220.INSR	Thermofisher scientific	Hs00961554_m1
CD24.HSA	Thermofisher scientific	Hs03044178_g1
NCOR1	Thermofisher scientific	Hs01094540_m1
CD26.DPP4	Thermofisher scientific	Hs00175210_m1
CD274	Thermofisher scientific	Hs01125301_m1
CD276	Thermofisher scientific	Hs00987207_m1
CD32.FCGR2B	Thermofisher scientific	Hs01634996_s1
CD33	Thermofisher scientific	Hs01076281_m1
CD34	Thermofisher scientific	Hs00990732_m1
CD344.FZD4	Thermofisher scientific	Hs00201853_m1
CD352.SLAMF6	Thermofisher scientific	Hs01559920_m1
CD38	Thermofisher scientific	Hs01120071_m1
CD4	Thermofisher scientific	Hs01058407_m1
CD41.ITGA2B	Thermofisher scientific	Hs01116228_m1
CD49f.ITGA6	Thermofisher scientific	Hs01041011_m1
CD56.NCAM1	Thermofisher scientific	Hs00941830_m1
CD9	Thermofisher scientific	Hs00233521_m1
CD97	Thermofisher scientific	Hs00173542_m1
CD99	Thermofisher scientific	Hs00908458_m1
CDK6	Thermofisher scientific	Hs01026371_m1
CDKN1A	Thermofisher scientific	Hs00355782_m1
CDKN1B	Thermofisher scientific	Hs01597588_m1
CDKN1C	Thermofisher scientific	Hs00175938_m1
CEBPa	Thermofisher scientific	Hs00269972_s1
CSF1r	Thermofisher scientific	Hs00911250_m1
CSF2RA	Thermofisher scientific	Hs00531296_g1
CSF3RA	Thermofisher scientific	Hs01114427_m1
E2A.TCF3	Thermofisher scientific	Hs00413032_m1
EBF1	Thermofisher scientific	Hs01092694_m1
ENG	Thermofisher scientific	Hs00923996_m1
EPOR	Thermofisher scientific	Hs00959427_m1
ERG	Thermofisher scientific	Hs01554629_m1
FLI1	Thermofisher scientific	Hs00956711_m1
FLT3	Thermofisher scientific	Hs00174690_m1
FOXO1	Thermofisher scientific	Hs01054576_m1
GAPDH	Thermofisher scientific	Hs02758991_g1
GATA1	Thermofisher scientific	Hs00231112_m1
GATA2	Thermofisher scientific	Hs00231119_m1
GATA3	Thermofisher scientific	Hs00231122_m1
GFI1	Thermofisher scientific	Hs00382207_m1
HES1	Thermofisher scientific	Hs01118947_g1
HLF	Thermofisher scientific	Hs00171406_m1
HMGA2	Thermofisher scientific	Hs00171569_m1
HOXA5	Thermofisher scientific	Hs00430330_m1
HOXB4	Thermofisher scientific	Hs00256884_m1
ID2	Thermofisher scientific	Hs04187239_m1
IGF2BP1	Thermofisher scientific	Hs00198023_m1
IGF2BP2	Thermofisher scientific	Hs01118009_m1
IKZF1	Thermofisher scientific	Hs00172991_m1
IL1RAP	Thermofisher scientific	Hs00895050_m1
IL2RG	Thermofisher scientific	Hs00953624_m1
IRF8	Thermofisher scientific	Hs00175238_m1
ITGB7	Thermofisher scientific	Hs01565750_m1
KIT	Thermofisher scientific	Hs00174029_m1
Lin28B	Thermofisher scientific	Hs01013729_m1
LMO2	Thermofisher scientific	Hs00153473_m1
LYL1	Thermofisher scientific	Hs01089802_g1
Meis1	Thermofisher scientific	Hs01017441_m1
mKi67	Thermofisher scientific	Hs01032443_m1
MPL	Thermofisher scientific	Hs00180489_m1
MPO	Thermofisher scientific	Hs00924296_m1
NFIB	Thermofisher scientific	Hs01029175_m1
Notch1	Thermofisher scientific	Hs01062011_m1
Pten	Thermofisher scientific	Hs02621230_s1
RAG2	Thermofisher scientific	Hs01851142_s1
RPS18	Thermofisher scientific	Hs01375212_g1
RUNX1	Thermofisher scientific	Hs00231079_m1
Shisa2	Thermofisher scientific	Hs01590823_m1
Spi1	Thermofisher scientific	Hs02786711_m1
Sterile.IgH	Thermofisher scientific	Hs00378435_m1
TAL1	Thermofisher scientific	Hs01097987_m1
THY1	Thermofisher scientific	Hs00264235_s1
Tim.3.HAVCR2	Thermofisher scientific	Hs00958618_m1
VWF	Thermofisher scientific	Hs00169795_m1