Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor
Summary
Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.
Abstract
Caracterização imunofenotípica e análise molecular tem sido muito utilizados para delinear a heterogeneidade e definir populações de células distintas. FACS é inerentemente um ensaio de célula única, no entanto antes da análise molecular, as células de destino são isoladas frequentemente prospectivamente a granel, perdendo assim a resolução de célula única. Análise da expressão de gene de célula única fornece um meio para compreender diferenças moleculares entre células individuais em populações de células heterogêneas. Na análise de células em massa uma sobre-representação de um tipo de células distintas resulta em preconceitos e oclusões de sinais de células raras com importância biológica. Utilizando o FACS índice classificação acoplado a análise da expressão de gene de célula única, populações podem ser investigadas sem perda de resolução de célula única enquanto células com expressão de marcador de superfície de célula intermediária também são capturadas, permitindo a avaliação de a relevância da expressão do marcador de superfície contínua. Aqui, descrevemos uma abordagem que combina célula única transcrição reversa quantitativo PCR (RT-qPCR) e FACS índice classificação para caracterizar simultaneamente o molecular e imunofenotípica heterogeneidade dentro de populações de células.
Em contraste com os métodos de sequenciamento de RNA célula única, o uso de qPCR com amplificação de destino específico permite para medições robustas de baixa abundância transcrições com menos interrupções, enquanto isso não é confundido por questões relacionadas às variações de célula para célula em leitura profundidade. Além disso, por diretamente esse método de buffer de ordenação de índice único-células em Lise, permite para a síntese do cDNA e pré-amplificação alvo específico para ser executada em uma única etapa, bem como quanto à correlação de assinaturas moleculares posteriormente derivadas com superfície celular expressão do marcador. A abordagem descrita foi desenvolvida para investigar single-células hematopoiéticas, mas também têm sido utilizados com sucesso em outros tipos de células.
Em conclusão, a abordagem aqui descrita permite medição sensível da expressão de RNAm para um painel de genes pré-selecionados com a possibilidade para desenvolver protocolos para isolamento prospectivo subsequente de subpopulações molecularmente distintas.
Introduction
Cada célula individual do sangue é acreditada para residir em uma hierarquia de celular, onde as células-tronco formam o ápice em cima de uma série de progenitores intermediários cada vez mais comprometidos que eventualmente terminal se diferenciar em células efetoras final carregando específicas funções biológicas1. Muito do conhecimento sobre como os sistemas de células-tronco são organizados foi gerado no sistema hematopoiético, em grande parte devido a capacidade de isolar prospectivamente distintas populações hematopoiéticas altamente enriquecidas para células-tronco ou progenitoras vários2 , classificando o FACS. Isto permitiu para muitas dessas populações a serem analisados funcionalmente ou molecularmente, predominantemente através da expressão do gene de perfil3,4. No entanto quando analisando a expressão gênica das diferenças individuais de em massa das populações entre as células são em média para fora e perdeu5. Assim, incapacidade para detectar variações de célula para célula dentro frações heterogêneas célula pode confundir nosso entendimento de processos biológicos críticos se pequenos subconjuntos de células esclarecem a função biológica inferida do que a população6, 7. Por outro lado, investigação das assinaturas de expressão do gene na célula única resolução oferecem uma possibilidade de delinear a heterogeneidade e contornar a sombra influências de sobre-representados subconjuntos de células8.
Até à data têm sido desenvolvidos muitos protocolos para análise de expressão do gene de célula única; com cada abordagem tendo suas próprias limitações. O método mais antigo foi RNA fluorescente em situ hibridação (RNA-FISH), que mede um número limitado de transcrições de cada vez, mas é o único que permite a investigação de RNA localização9,11. Início métodos usando PCR e qPCR para detectar que um único ou poucos transcrições foram também desenvolvidos12. No entanto, estas ultimamente foram substituídas por métodos baseados em microfluídica que podem analisar simultaneamente a expressão de centenas de transcrições por célula em centenas de células através da qPCR e assim permitir para o uso de análise dimensional elevada heterogeneidade Pre-determinado gene painéis10,13. Recentemente tecnologias baseadas em sequenciamento de RNA tem tornar-se amplamente utilizadas para análise de célula única, como estes teoricamente podem medir a transcriptoma inteira de uma célula e, assim, adicionar uma dimensão exploratória a heterogeneidade análise10, 14. análise de qPCR multiplexados e sequenciamento de RNA de célula única têm características diferentes, assim, a justificativa para usar um dos métodos depende a pergunta, bem como o número de células na população-alvo. A alta produtividade e baixo custo por célula juntamente com características imparciais, exploratórias de sequenciamento de RNA de célula única são desejáveis quando célula desconhecida ou grandes populações são investigadas. No entanto, a sequenciação do ARN de célula única também é inclinada para sequenciamento transcrições abundantes altas mais frequentemente enquanto transcrições com baixa abundância são propensas a desistentes. Isso pode levar a dados consideravelmente complexos que coloca exigências de alta na análise de bioinformatic revelar importantes sinais moleculares que são muitas vezes sutis ou ocultas em ruído técnica15. Assim, para tecidos bem caracterizados, qPCR célula única análise usando pre-determinada painéis cartilha selecionados para funcionalmente importantes genes ou marcadores moleculares podem servir como uma abordagem sensível, simples para determinar a heterogeneidade de um população. No entanto, deve notar-se que em relação à célula única RNA-seq, o custo de cada célula é geralmente maior para métodos de célula única qPCR. Aqui, descrevemos uma abordagem que combina monocelulares RT-qPCR (modificado de J. Teles et al 16), índice de FACS classificação17 e bioinformática análise18 para simultaneamente caracterizam a heterogeneidade molecular e imunofenotípica dentro das populações.
Nesta abordagem, a população de células de interesse está manchada, e single-células são classificadas por FACS diretamente em tampão de Lise em placas de PCR de 96 poços. Simultaneamente, os níveis de expressão de um conjunto adicional de marcadores de superfície celular são registrados para cada célula única durante FACS-classificação, um método que é conhecido como índice de classificação. O material de lisados celulares é posteriormente amplificado e a expressão do gene de um conjunto selecionado de genes analisados com RT-qPCR, usando uma plataforma microfluidic. Esta estratégia permite a análise molecular da caracterização de célula única, bem como simultânea classificada de expressão do cada célula marcador da pilha-superfície. Mapeando diretamente molecularmente distintos subconjuntos de células para a expressão dos marcadores classificadas de indexado, as subpopulações podem ser vinculadas a um imunofenótipo específico que pode ser usado para seu isolamento em perspectiva. O método é descrito passo a passo na Figura 1. Um painel pre-determinado gene mais contribui para uma maior resolução da expressão do gene alvo, desde que contorna a medição dos genes abundantes irrelevantes que caso contrário pode ocluir os sinais de expressão do gene sutil. Além disso, a amplificação de destino específico, transcrição reversa de um passo e amplificação permite a medição robusta de baixas transcrições expressadas, como factores de transcrição ou RNAs não-poli-adenylated. Importante, qPCR métodos permitem a medição de mRNA de proteínas da fusão, que são importantes na investigação de determinadas doenças malignas,19. Finalmente, o foco número dos genes investigados, baixas taxas de abandono, e limitado as diferenças técnicas entre as células fazem este método facilmente analisado em comparação com métodos dimensionais mais elevados, como célula única RNA-Seq Seguindo o protocolo, pode ser realizada uma experiência inteira, de classificação células para resultados analisados, no prazo de três dias, tornando este um método simples e rápido para análise de expressão do gene de célula única sensível, elevado-throughput.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos últimos anos, a análise da expressão de gene de célula única tornou-se uma adição valiosa para definir a heterogeneidade de várias populações de nível23. O advento das tecnologias de sequenciamento de RNA teoricamente fornece a possibilidade de medir a transcriptoma inteira de uma célula, no entanto, esses métodos são complicados por variações em profundidades de sequenciamento de célula para célula e abandono. Célula única qPCR oferece uma análise sensível e robusta da e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por subsídios da sociedade sueca de câncer, o Conselho Sueco de pesquisa, a sociedade sueca para pesquisa médica, o sueco Childhood Cancer Foundation, a Fundação de Ragnar Söderberg e The Knut e Alice Wallenberg Foundation
Materials
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
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| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
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| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
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| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
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| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
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| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
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| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
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| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
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| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
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| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
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| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
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| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
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