Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici
Summary
Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l’indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.
Abstract
Immunophenotypic caratterizzazione e l’analisi molecolare sono stati utilizzati a lungo per eterogeneità di delineare e definire popolazioni distinte delle cellule. FACS è intrinsecamente un’analisi unicellulare, tuttavia prima di analisi molecolare, cellule bersaglio sono spesso prospetticamente isolate all’ingrosso, perdendo così la cella singola ad alta risoluzione. Analisi dell’espressione genica di singola cellula fornisce un mezzo per capire le differenze molecolari tra le singole celle in popolazioni eterogenee delle cellule. In analisi di massa cellulare una sovrarappresentazione di un tipo di distinte delle cellule provoca pregiudizi e occlusioni dei segnali dalle cellule rare con importanza biologica. Utilizzando FACS Indice ordinamento accoppiato all’analisi dell’espressione genica di singola cellula, popolazioni possono essere indagate senza perdita di risoluzione di singola cellula mentre le cellule con espressione di superficie dell’indicatore delle cellule intermedie vengono inoltre acquisite, consentendo la valutazione dei la rilevanza dell’espressione dei marker di superficie continua. Qui, descriviamo un approccio che combina cella singola trascrizione d’inversione quantitativa PCR (RT-qPCR) e FACS Indice ordinamento contemporaneamente caratterizzazione molecolare e immunophenotypic eterogeneità all’interno di popolazioni cellulari.
Contrariamente ai metodi di sequenziamento di cella singola del RNA, l’uso di qPCR con amplificazione del target specifico permette per misurazioni robusti di basso-abbondanza trascritti con meno interruzioni, mentre non è confuso da questioni legate alle variazioni della cellula–cellula in lettura profondità. Inoltre, da direttamente questo metodo buffer indice-ordinamento single-cellule in Lisi, permette per la sintesi del cDNA e target specifico pre-amplificazione per essere eseguite in un unico passaggio anche per quanto riguarda la correlazione delle firme molecolari successivamente derivate con superficie cellulare espressione del marcatore. L’approccio descritto è stato sviluppato per indagare su singolo-cellule ematopoietiche, ma inoltre sono stati usati con successo su altri tipi di cellule.
In conclusione, l’approccio descritto nel presente documento consente una misura sensibile dell’espressione di mRNA per un pannello di geni pre-selezionati con la possibilità di sviluppare protocolli per successivo isolamento futuri dei molecolarmente distinte sottopopolazioni.
Introduction
Ogni singola cellula del sangue è creduto di risiedere in una gerarchia cellulare, dove le cellule staminali formano l’apice in cima a una serie di sempre più progenitori intermedi che alla fine terminalmente differenziarsi nelle cellule effettrici finale che trasportano specifici funzioni biologiche1. Molte delle conoscenze su come sono organizzati i sistemi di cellule staminali è stato generato nel sistema ematopoietico, in gran parte a causa della capacità di isolare prospetticamente distinte popolazioni ematopoietiche altamente arricchiti per le cellule staminali o vari progenitori2 ordinando FACS. Questo ha permesso per molti di queste popolazioni di essere analizzato funzionalmente o molecolare, principalmente attraverso profili di espressione genica3,4. Tuttavia quando l’analisi di espressione genica delle differenze individuali di popolazioni di massa tra cellule sono mediati e perso5. Così, incapacità di rilevare variazioni di cellula–cellula all’interno delle frazioni eterogenee delle cellule può confondere la nostra comprensione dei processi biologici critici se piccoli sottoinsiemi di cellule conto per la funzione biologica dedotta di quella popolazione6, 7. Al contrario, indagine di firme di espressione del gene a cella singola risoluzione offrono una possibilità delineare eterogeneità ed eludere adombrante influenze da sovrarappresentati sottoinsiemi di cellule8.
Ad oggi sono stati sviluppati molti protocolli per analisi di espressione genica di cella singola; ogni approccio avendo propri avvertimenti. Il primo metodo era RNA fluorescente in situ ibridazione (RNA-FISH), che misura un numero limitato di trascrizioni in un momento, ma è unico in quanto permette per indagine di RNA localizzazione9,11. I primi metodi usando PCR e qPCR per rilevare che un singolo o trascrizioni molto pochi sono stati anche sviluppati12. Tuttavia, questi ultimamente sono stati sostituiti da metodi basati su microfluidica che possono analizzare simultaneamente l’espressione di centinaia di trascrizioni per ogni cella in centinaia di cellule attraverso qPCR e pertanto consentono di dimensione elevata eterogeneità analisi utilizzando pre-determinato gene pannelli10,13. Recentemente la tecnologie basate su sequenze di RNA sono stato ampiamente usate per analisi unicellulare, come teoricamente possono misurare l’intero trascrittoma di una cella e quindi aggiungere una dimensione esplorativa alla eterogeneità analisi10, 14. Multiplexed qPCR analisi e sequenziamento di RNA di singole cellule hanno caratteristiche diverse, così lo spiegazione razionale per usando uno dei metodi dipende la domanda così come il numero delle cellule nella popolazione bersaglio. Ad alta velocità e basso costo per cella nonché caratteristiche imparziali, esplorative del sequenziamento di RNA di singola cellula sono consigliabili quando cella sconosciuto o grandi popolazioni sono studiati. Tuttavia, sequenziamento di RNA di singola cellula inoltre è sbilanciata verso il sequenziamento alte abbondante trascrizioni più frequentemente mentre trascrizioni con abbondanza bassa sono inclini ai forcellini. Questo può portare a dati notevolmente complessa che mette alto-richieste su analisi bioinformatica per rivelare importanti segnali molecolari che sono spesso sottili o nascosto nel rumore tecnico15. Così, per tessuti ben caratterizzati, qPCR cella singola analisi utilizzando pre-determinato pannelli primer selezionati per geni funzionalmente importanti o marcatori molecolari possono servire come un approccio sensibile, semplice per determinare l’eterogeneità di un popolazione. Tuttavia, dovrebbe essere notato che, rispetto a cella singola RNA-seq, il costo per ogni cella è generalmente maggiore per cella singola qPCR metodi. Qui, descriviamo un approccio che unisce unicellulare RT-qPCR (modificato da Teles J. et al. 16), all’indice di FACS ordinamento contemporaneamente analisi bioinformatica e17 18 al fine di caratterizzare l’eterogeneità molecolare e immunophenotypic all’interno delle popolazioni.
In questo approccio, la popolazione delle cellule di interesse è macchiata e singolo-cellule sono filtrate di FACS direttamente nel buffer di lisi in piastre PCR a 96 pozzetti. Contemporaneamente, i livelli di espressione di un ulteriore set di marcatori di superficie cellulare vengono registrati per ogni singola cella durante FACS-ordinamento, un metodo che è indicato come indice di ordinamento. Il materiale di lisato cellulare viene successivamente amplificato e l’espressione genica di un insieme selezionato di geni analizzati con RT-qPCR, utilizzando una piattaforma microfluidica. Questa strategia consente l’analisi molecolare della caratterizzazione del ordinato unicellulare, nonché simultanea dell’espressione di marcatori di superficie cellulare di ogni singola cella. Mappando direttamente molecolarmente distinte sottopopolazioni di cellule per l’espressione dei marcatori ordinati indicizzati, le sottopopolazioni possono essere collegate a un immunophenotype specifico che può essere utilizzato per il loro isolamento futuri. Il metodo è descritto passo per passo nella Figura 1. Un pannello di pre-determinato gene ulteriormente contribuisce a una maggiore risoluzione dell’espressione genica mirata, poiché aggira misura irrilevante geni abbondanti che altrimenti possono occludere segnali di espressione del gene sottile. Inoltre, l’amplificazione dell’obiettivo specifico, la trascrizione inversa di un passo e amplificazione permette misurazione robusto di basse trascrizioni espresse, come fattori di trascrizione o RNA non-poli-adenylated. Importante, qPCR metodi consentono per la misura di mRNA da proteine di fusione, che sono importanti durante l’analisi di alcune malattie maligne19. Infine, il numero concentrato di geni studiati, bassi tassi di abbandono, e limitate differenze tecniche tra cellule rendono questo metodo facilmente analizzabile rispetto ai metodi dimensionale superiore, come cella singola RNA-seq. Seguendo il protocollo, un intero esperimento può essere eseguito, da ordinamento celle a risultati analizzati, entro tre giorni, rendendo questo un metodo semplice e veloce per analisi di espressione genica di singole cellule sensibili, ad alta velocità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi anni, analisi di espressione genica di singola cellula è diventata una preziosa aggiunta per definire l’eterogeneità delle varie popolazioni di cellule23. L’avvento delle tecnologie di sequenziamento di RNA fornisce teoricamente la possibilità di misurare l’intero trascrittoma di una cella, tuttavia questi metodi sono complicati tramite le variazioni nella profondità della cellula–cellula sequenziamento e drop-out. Cella singola qPCR offre un’analisi sensibile e robusta dell’espr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dal Swedish Cancer Society, The Swedish Research Council, la società svedese per la ricerca medica, la svedese infanzia Cancer Foundation, la Fondazione di Ragnar Söderberg e The Knut e Alice Wallenberg Foundation
Materials
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
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