Summary
معظم الجينات التعبير القياسات سحابة خلية فردية الاختلافات في الخلية غير المتجانسة السكان. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تحليل التعبير الجيني كيف خلية واحدة وفهرس الفرز بالتنوير تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ويمكن الجمع بين تحديد عدم التجانس وإيمونوفينوتيبيكالي تميز سكان الخلية جزيئيا متميزة.
Abstract
قد استخدمت منذ فترة طويلة إيمونوفينوتيبيك الوصف والتحليل الجزيئي تحدد عدم التجانس وتعريف السكان خلية متميزة. نظام مراقبة الأصول الميدانية أصلاً مقايسة خلية واحدة، لكن السابقة للتحليل الجزيئي، الخلايا الهدف غالباً مستقبلي معزولة بكميات كبيرة، وبالتالي فقدان القرار خلية واحدة. تحليل التعبير الجيني خلية واحدة يوفر وسيلة لفهم الاختلافات الجزيئية بين خلايا فردية في الخلية غير المتجانسة السكان. في جل خلية تحليل النتائج التمثيل المفرط لنوع الخلية متميزة في التحيزات وانسداد إشارات من خلايا نادرة مع الأهمية البيولوجية. باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز الفهرس بالإضافة إلى تحليل التعبير الجيني خلية واحدة، يمكن التحقيق السكان دون فقدان القرار خلية واحدة بينما هي أيضا القبض على الخلايا مع الخلايا الوسيطة التعبير علامة السطحية، مما يتيح تقييم أهمية التعبير علامة السطحية المستمرة. هنا، يمكننا وصف نهج يجمع بين النسخ العكسي خلية واحدة الكمي PCR (RT-qPCR) ونظام مراقبة الأصول الميدانية فهرس الفرز في نفس الوقت تميز الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك داخل الخلية السكان.
على النقيض من أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يتيح استخدام qPCR مع التضخيم مستهدفة محددة لقياسات قوية منخفضة-وفرة النصوص مع عدد المنقطعين عن الدراسة، في حين أنه هو مرتبك لا بالقضايا المتصلة بخلية إلى الاختلافات في القراءة العمق. وعلاوة على ذلك، قبل مباشرة خلايا مفردة الفرز الفهرس إلى تفسخ المخزن المؤقت هذا الأسلوب، يسمح لتوليف كدنا ومستهدفة محددة قبل التضخيم تتم في خطوة واحدة، وكذلك فيما يتعلق بارتباط التوقيعات الجزيئية المشتقة في وقت لاحق مع سطح الخلية علامة التعبير. قد وضعت هذا النهج المبين للتحقيق واحد-الخلايا المكونة للدم، ولكن أيضا قد استخدمت بنجاح في أنواع الخلايا الأخرى.
وفي الختام، يسمح النهج المبينة في هذا التقرير لقياس حساسية التعبير مرناً للوحة من جينات محددة مسبقاً مع إمكانية وضع بروتوكولات لعزل المحتملين اللاحقة للفئات السكانية الفرعية جزيئيا متميزة.
Introduction
ويعتقد كل خلية الدم الفردية الموجودة في التسلسل هرمي خلوية، حيث تشكل الخلايا الجذعية قمة على رأس مجموعة من التزام متزايد المتكفل الوسيطة التي تميز في نهاية المطاف الميؤوس من شفائهم في خلايا المستجيب النهائي تحمل محددة 1من الوظائف البيولوجية. الكثير من المعرفة حول كيفية تنظيم نظم الخلايا الجذعية تم إنشاؤها في نظام المكونة للدم، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى القدرة على عزل مستقبلي متميز السكان المكونة للدم العالي التخصيب للخلايا الجذعية أو فروعه المختلفة2 عن طريق فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. وقد أتاح للعديد من هؤلاء السكان يتم تحليلها وظيفيا أو جزيئيا، في الغالب من خلال التعبير الجيني التنميط3،4. ومع ذلك عندما تحليل التعبير الجيني لمعظم السكان الفروق الفردية بين الخلايا بلغ وفقدت5. وبالتالي، عدم القدرة على الكشف عن الاختلافات خلية إلى خلية داخل الخلية غير متجانسة الكسور قد إرباك فهمنا للعمليات البيولوجية الحرجة إذا كان حساب مجموعات فرعية صغيرة من الخلايا للوظيفة البيولوجية تم استنتاجه من أن السكان6، 7. على العكس من ذلك، التحقيق في التوقيعات التعبير الجيني في القرار خلية واحدة تتيح إمكانية تحديد عدم التجانس والالتفاف حول التأثيرات تحجب من مجموعات فرعية زائداً من الخلايا8.
وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتحليل التعبير الجيني خلية واحدة حتى الآن؛ مع كل نهج وبعد التحذيرات الخاصة به. وكان الأسلوب أقرب الحمض النووي الريبي الفلورسنت في الموقع التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك)، الذي يقيس عدد محدود من النصوص في وقت واحد ولكن هي فريدة من نوعها حيث يسمح للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي ومسلم9،11. تطوير أساليب المبكر باستخدام PCR و qPCR للكشف عن واحدة أو نسخ قليلة جداً وكانت أيضا12. ومع ذلك، هذه في الآونة الأخيرة تم استبدال بالأساليب المستندة إلى ميكروفلويديكس التي يمكن تحليل التعبير عن مئات نصوص كل خلية في مئات خلايا عن طريق قبكر في أن واحد وتسمح بالتالي لاستخدام تحليل التباين العالي ثلاثي الأبعاد تحدد مسبقاً الجينات لوحات10،13. مؤخرا التكنولوجيات المستندة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي قد أصبحت تستخدم على نطاق واسع لتحليل خلية مفردة، هذه من الناحية النظرية يمكن أن قياس الترنسكربيتوم كامل من خلية وأضفى بعدا استكشافية إلى التغايرية تحليل10، 14. مولتيبليكسيد قبكر تحليل وتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة لها ملامح مختلفة، وبالتالي أن الأساس المنطقي لاستخدام أي من الأساليب يعتمد على السؤال فضلا عن العدد الخلايا في المجموعة السكانية المستهدفة. ومن المستصوب الفائق، وتكلفة منخفضة للخلية جنبا إلى جنب مع خصائص غير منحازة، واستكشافية لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة عندما يتم التحقيق في الخلية غير معروف أو إعداد كبيرة من السكان. ومع ذلك، هو أيضا منحازة تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة تسلسل النصوص وفرة عالية أكثر تواترا بينما النصوص مع وفرة منخفضة معرضة للانقطاع عن الدراسة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى البيانات المعقدة إلى حد كبير أن يضع مطالب عالية على تحليل بيوينفورماتيك للكشف عن الإشارات الجزيئية الهامة التي غالباً ما تكون خفية أو المخفية في الضوضاء التقنية15. وهكذا، للأنسجة تتميز جيدا، قبكر خلية واحدة باستخدام تحليل تحدد مسبقاً التمهيدي لوحات مختارة للجينات وظيفيا هاما أو الواسمات الجزيئية بمثابة نهج حساسية واضحة لتحديد عدم تجانس السكان. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المقارنة للحمض النووي الريبي خلية واحدة-seq، تكلفة كل خلية أعلى بصفة عامة لأساليب qPCR خلية واحدة. وهنا يصف لنا نهجاً يجمع بين خلية واحدة RT-قبكر (تعديل من تيليس J. et al. 16)، إلى فهرس نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز17 والمعلوماتية الحيوية التحليل18 من أجل في نفس الوقت تميز التغايرية الجزيئية وإيمونوفينوتيبيك ضمن السكان.
في هذا النهج، هو الملون السكان خلية للفائدة، وخلايا مفردة يتم فرزها حسب الأصول مباشرة إلى المخزن المؤقت لتحلل في لوحات بكر 96-جيدا. في نفس الوقت، يتم تسجيل مستويات التعبير من مجموعة إضافية من علامات سطح الخلية لكل خلية واحدة خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز، أسلوب الذي يشار إليه كفهرس الفرز. بعد ذلك يتم تضخيمه بتفكيك خلية المواد وتحليل التعبير الجيني لمجموعة مختارة من الجينات مع RT-قبكر، باستخدام منصة موائع جزيئية. تمكن هذه الاستراتيجية التحليل الجزيئي لتوصيف خلية واحدة فضلا عن تزامن مفروزة التعبير علامة الخلية-سطح كل خلية فردية. عن طريق تعيين مجموعات فرعية متميزة جزيئيا من الخلايا مباشرة للتعبير عن علامات مفروزة المفهرسة، يمكن ربطها الفئات السكانية الفرعية إيمونوفينوتيبي محددة التي يمكن استخدامها لعزلتها المحتملين. ويرد الأسلوب خطوة بخطوة في الشكل 1. لوحة جينات محددة سلفا كما يسهم في دقة أعلى تعبير الجينات المستهدفة، حيث أنها تلتف القياس غير ذي صلة الجينات الوفيرة التي يمكن لولا ذلك أوككلودي إشارات التعبير الجيني خفية. وعلاوة على ذلك، يسمح التضخيم مستهدفة محددة، خطوة واحدة النسخ العكسي، وتضخيم لقياس قوة النصوص أعرب منخفضة، مثل عوامل النسخ أو الكشف غير بولي-أدينيلاتيد. الأهم من ذلك، تسمح أساليب qPCR لقياس مرناً من البروتينات الانصهار، ومهمة عند التحقيق في بعض الأمراض الخبيثة19. وأخيراً، التحقيق تركز عدد الجينات، انخفاض معدلات التسرب، والاختلافات التقنية المحدودة بين جعل الخلايا بسهولة تحليل هذا الأسلوب مقارنة بالأساليب الأبعاد أعلى، مثل الحمض النووي الريبي خلية واحدة-ما يليها باتباع البروتوكول، يمكن إجراء تجربة كاملة، من فرز الخلايا لتحليل النتائج، في غضون ثلاثة أيام، مما يجعل هذا طريقة غير معقدة وسريعة لتحليل التعبير الجيني وحيدة الخلية الحساسة، والفائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد لوحات تحلل
- استخدام مقعد مجاناً الحمض النووي الريبي/الحمض النووي، إعداد المخزن المؤقت تحلل ما يكفي للآبار 96، مع 10% إضافية، بخلط المياه مجاناً nuclease ميليلتر 390, ميليلتر 17% 10 NP-40، 2.8 دنتب ملم 10 ميليلتر، 10 ميليلتر 0.1 M DTT ومثبط رناسي ميليلتر 5.3 (انظر الجدول للمواد). دوامة وتدور إلى أسفل.
- توزيع 4 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت لكل بئر من صفيحة بكر جيدا 96 وختم اللوحات مع الفيلم لاصقة. تدور أسفل أنابيب لجمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات. تبقى لوحات على الجليد حتى الخلية الفرز (خلال ال 24 ساعة كحد أقصى).
2-إعداد الخلايا للخلية الفرز
- ذوبان الجليد عدد مناسب من الخلايا (هنا، CD34 المخصب الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف) للتجربة. 1 × 106 خلايا تكون مناسبة لفرز حوالي ثلاث لوحات 96-جيدا من خلايا مفردة مع عناصر التحكم.
- نقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي 15 مل ثم أضف 1 مل FBS كل 30 ثانية حتى يتم الوصول إلى وحدة تخزين إجمالي 8 مل. تدور الخلايا في أجهزة الطرد مركزي في 350 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 8 مل تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني مع 2% FBS) والطرد المركزي في 350 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
- المخزن المؤقت ريسوسبيند الخلايا في تلطيخ 200 ميليلتر وإزالة الخلايا لمراقبة البقع.
- جعل Fluorescence ناقص واحد عناصر التحكم (فموس) لكل فلوروفوري، تلطيخ جزء صغير من خلايا في 50 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت. في هذا المثال، يتم استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 6 مع خلايا 20,000 فموس. علما أن عدد الخلايا ينبغي أن تعدل تبعاً للسكان بالتحقيق. إضافة جميع الأجسام المضادة في تركيز نفسه كما هو الحال في وصمة عار عينة باستثناء حالة واحدة لكل أنبوبة.
- جعل البقع واحد لكل فلوروفوري بتلوين جزء بسيط خلايا في 50 ميليلتر العازلة لكل فلوروفوري المستخدمة. في هذا المثال يتم استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 6 مع خلايا 20,000. علما بأن الهدف المحدد لكل جسم يحتاج إلى التعبير عن طريق الخلايا المستخدمة لعناصر التحكم. إضافة كل جسم في تركيز نفسه كما هو الحال في عينة وصمة عار في أنابيب فردية. بالإضافة إلى ذلك تبقى 20,000 الخلايا أونستينيد في 50 ميليلتر كعنصر تحكم أونستينيد.
- نموذج الخلية، إضافة الأجسام المضادة تركيز مناسب. المستخدمة هنا هي CD34-فيتك بتركيز 1/100، CD38-آسيا والمحيط الهادئ 1/50، CD90-بي 1/10، CD45RA-bv421 1/50، CD49F-PECy7 1/50، ومزيج النسب: CD3-PECy5 1/50، CD2-PECy5 1/50، CD19-PECy5 1/50، CD56-PECy5 1/50، CD123-PECy5 1/50، CD14-PECy5 1/50، CD16-PECy5 1/50، و CD235a-PECy5 1/1000.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
- تغسل الخلايا مع 3 مل تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي خلايا في 350 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا وكرر الخطوة 2.9.
- ريسوسبيند العينة في 500 ميليلتر وفموس في 100 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت مع خلايا 7AAD وتصفية 1/100 من خلال عامل تصفية 50 ميكرون الحصول على تعليق خلية واحدة.
3-الخلية الفرز
- تأكد من أن يتم تعيين الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية حتى بشكل صحيح مع تأخير الإسقاط والإعداد سيتوميتير وتتبع (لجنة العلم والتكنولوجيا) التي تم تنفيذها مؤخرا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، لضمان أن يتم فرز الخلايا المناسبة. للخلايا المكونة للدم، وينصح استخدام 85 ميكرون فوهة وبأقصى سرعة 4، بينما معدل الحدث الأمثل ما بين 800 و 2000 الأحداث/s.
- تصحيح التداخل الطيفي بأداء تعويض الأسفار وتعيين غيتس وفقا لضوابط FMO أو الضوابط الداخلية السلبية.
- إجراء تحليل للسكان المستهدفين بفرز الخلايا الهدف على الأقل 100 في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت وصمة عار. نظام مراقبة الأصول الميدانية تحليل الخلايا تم فرزها بتسجيل العينة تم فرزها والتأكد من أن أنها في نهاية المطاف في بوابة الفرز.
- إنشاء لوحة خلية واحدة الفرز حسب تركز الانخفاض في A1 جيدا في صفيحة جيدا 96. عندما يتم توسيطه، فرز 50 – 100 6 ميكرومتر الجسيمات في جميع الآبار حول حافة صفيحة جيدا 96 فارغة التأكد من أن جميع الآبار سوف تحصل على خلية في المركز من كل بئر.
- إذا كان ذلك ممكناً، يمكن إضافة عنصر تحكم إضافية لضمان أن يتم فرز الخلايا قابلة للاستمرار بفرز الخلايا وحيدة للنمو في المختبر . يمكن زراعة خلايا الدم في لوحات 96 يو-أسفل جيدا في 100 ميليلتر سفيم مع 1% البنسلين والستربتوميسين، 100 نانوغرام/مل FLT3L، ومنظمات ترويج التجارة، وصندوق إنقاذ الطفولة. تحليل كل بئر بعد 3 أيام في الثقافة للمستعمرات الخلية باستخدام مجهر.
- إزالة الفيلم لاصقة من لوحات. تنشيط نوع خلية واحدة من الفائدة (هنا لين-CD34 + CD38-الخلايا) إلى 92 من الآبار 96، فهرس الفرز في الأصول فرز البرامج لحفظ التشكيل الجانبي إيمونوفينوتيبيك لعلامات أخرى للفائدة (هنا CD45RA و CD49f و CD90) لكل خلية مفردة.
- فرز بئرين مع الخلايا 10 و 20 على التوالي لعناصر التحكم الخطي في التضخيم PCR. عادة ما تستخدم الآبار H1 و H2.
- إبقاء اثنين من الآبار دون أي الخلايا كقالب لا عناصر تحكم، عادة ما تكون آبار H3 و H4.
- ختم اللوحات مع الفيلم لاصقة واضحة وتدور اللوحات في 300 x ز لمدة 1 دقيقة قبل الأداة التجميد على الثلج الجاف.
- تخزين ألواح مجمدة في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: نقطة توقف آمنة. يمكن الاحتفاظ بفرزها وتفكيك الخلايا في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
4-عكس النسخ والتضخيم مستهدفة محددة
- إعداد ميكس التمهيدي لجميع الجينات 96 الأهداف بإضافة 2 ميليلتر لكل زوج التمهيدي، بما في ذلك التدبير المنزلي الجينات الإشعال والإشعال لارتفعت في مراقبة الجيش الملكي النيبالي، في 1.5 مل من أنبوب رناسي مجاناً على مقعد مجاناً في الجيش الملكي النيبالي/الحمض النووي. في حالة استخدام أجهزة الإشعال أقل من 96، إضافة وحدة تخزين ما يعادل nuclease المياه مجاناً للإشعال مفقود. كبسولة تفجير مرتبة كل على حدة بحيث تتطابق مع الفريق الجينات المرغوبة.
- جعل النسخ العكسي والتضخيم مستهدفة محددة المزيج بإضافة ميليلتر 632.5 2 x ميكس رد فعل، ميليلتر 101.2 بوليميراز/سوبيرسكريبتيي و 151.8 ميليلتر التمهيدي مزيج ميليلتر 0.7 ارتفعت في السيطرة على الجيش الملكي النيبالي. التشكيل هذه الخطوة على مقعد مجاناً الحمض النووي. مزيج من فورتيكسينج وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على الجليد حتى بالإضافة إلى العينة.
- جعل النسخ العكسي لا تحكم المزيج لأربعة آبار بخلط ميليلتر 27.5 2 x ميكس رد فعل، وميليلتر 1.76 إنزيم بوليميراز، 6.6 ميليلتر من التمهيدي مزيج وميليلتر 2.64 نوكلاس المياه مجاناً. سبايك في السيطرة على الجيش الملكي النيبالي. تنفيذ هذه الخطوة على مقعد مجاناً الحمض النووي. دوامة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب والحفاظ على الجليد حتى بالإضافة إلى عينة.
- ذوبان الجليد لوحات ليستي على الجليد. إضافة ميليلتر 8.75 النسخ العكسي معدّة مسبقاً ومزيج التضخيم مستهدفة محددة إلى 92 بئرا، بما في ذلك عناصر التحكم الخطي ولا القالب. إضافة ميليلتر 8.75 من النسخ العكسي لا تحكم المزيج إلى الآبار الأربعة المتبقية. ختم لوحات مع الفيلم لاصقة واضحة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.
- التشكيل النسخ العكسي والتضخيم مستهدفة محددة عن طريق تشغيل اللوحة في جهاز PCR طبقاً لبرنامج preamp؛ الخطوة 01:50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، الخطوة 2:95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والخطوة 3:95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الخطوة 4:60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، كرر الخطوات 3-4 24 مرات وأخيراً الخطوة 5:8 درجة مئوية إلى الأبد.
- بعد اكتمال الاسترداد، تبقى اللوحة 8 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير و-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: نقطة توقف آمنة. يمكن الاحتفاظ بمواد تضخيم 8 درجة مئوية للتخزين القصير الأجل وإلى-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
5-إعداد نماذج ولوحات الفحص لتحليل التعبير الجيني موائع جزيئية متعدد
- إعداد المقايسة تحميل لوحة بيبيتينج 3 ميليلتر المقايسة تحميل كاشف لكل بئر من صفيحة جيدا 96. إضافة 3 ميليلتر من كل التمهيدي إلى الآبار الفردية في مقايسة تحميل لوحة.
- ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.
- إعداد لوحة تمييع حلول ميليلتر 8 بيبيتينج من نوكلياسي المياه مجاناً إلى جميع الآبار من صفيحة جيدا 96. إضافة 2 ميليلتر من عينة تضخيم للوحة إضعاف، مما يجعل إضعاف نهائي من 1:5.
- ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة، ومزيج من لوحة فورتيكسينج لمدة 10 ثانية، وأخيراً تدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.
- إعداد مزيج تحميل العينة بعناية خلط ميليلتر 352 من مزيج الرئيسي مع 35.2 ميكروليتر من عينة تحميل كاشف. إعداد نموذج تحميل لوحة اليقوتينج 3.3 ميليلتر من تحميل ميكس لكل بئر من صفيحة جيدا 96.
- إضافة ميليلتر 2.7 من العينة المخففة في كل من العينة تحميل لوحة جيدا.
- ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.
6-تحميل رقاقة موائع جزيئية
- تأخذ بها رقاقة موائع جزيئية 96 × 96 جديدة. إعداد المداخل بدس لهم مع المحاقن مع غطاء على للتأكد من أنه يمكن نقلها.
- إزالة فقاعات من المحاقن. إضافة الحجم الكامل للمحاقن لكل صمام بينما إمالة الرقاقة 45 درجة والضغط الصمام. رئيس الوزراء رقاقة مع وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية.
- تحميل كل مدخل المقايسة مع 4.25 ميليلتر من كل من الآبار في مقايسة تحميل لوحة. تجنب الفقاعات. في حالة ظهور فقاعات في البئر، إزالتها مع تلميح ماصة.
- متابعة تحميل كل مدخل العينة مع 4.25 ميليلتر من كل من الآبار في العينة تحميل لوحة وتجنب فقاعات، وإذا لم تظهر فقاعات، إزالتها مع تلميح ماصة.
- تحميل رقاقة مع وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية.
- تحقق من أن الرقاقة تبدو حتى وأن تم تحميلها بجميع الدوائر. إزالة الغبار من على سطح رقاقة بلمسها مع الشريط. تشغيل شرائح في منهاج التعبير الجيني متعدد موائع جزيئية.
7-تشغيل شريحة على منصة التعبير متعدد الجينات موائع جزيئية
- بعد تحميل رقاقة في منهاج التعبير الجيني موائع جزيئية متعدد، اسم العينة.
- تعيين روكس كصبغة سلبية. تعيين المسبار واحد والاتحاد الماليزي-مغب الأسفار. استخدام v2 قياسي 96 × 96 كبروتوكول. بدء تشغيل.
- رقاقة إزالة عند تشغيل كاملة.
8-أولية تحليل تشغيل شريحة
- تحميل البيانات إلى برمجيات تحليل PCR الوقت الحقيقي.
- تحميل أسماء الجينات والخلايا عن طريق لصق التخطيطات الخلية والجينات من ملف محدد بعلامة جدولة.
- فتح طريقة عرض الصورة وحدد روكس كصبغ. تحقق إذا كانت جميع الآبار قد صبغ روكس السلبي.
- التحقيق إذا كان جميع التضخيم مؤامرات تبدو موافق، مع منحنى تضخيم سلس مع لا طفرات (مشابه الرقم 3E).
- تكفل لكل واحد-الخلايا التعبير ارتفعت في مراقبة الحمض النووي الريبي للتأكد من أن كل شيء قد جرى تحميلها بشكل صحيح.
- التأكد من أن كافة الخلايا التعبير الجيني التدبير المنزلي، وهكذا تم فرز بشكل صحيح.
- تضمن 10 و 20 من عناصر التحكم الخطي الخلية حوالي CT 1 الفرق للتحقق من صحة التضخيم الخطي.
- التحقق من ما إذا كان هناك تعبير في عينات مراقبة نورت. إذا تم الكشف عن التعبير في نورت بعين الاعتبار تغيير المسابير للتحقيقات التي لم يكشف المجينية الحمض النووي لتشغيل اللاحقة.
- تصدير البيانات في ملفات csv لمزيد من التحليل.
9-خلية واحدة التحليل باستخدام سسيكسف
ملاحظة: هذا فيلم تمهيدية هو الحالي20 إدخال الأداة. ويرد هنا، توصية قصيرة لكيفية القيام بالتحليل باستخدام عناصر التحكم الموجودة في البروتوكول.
- الاتصال ب موقع على شبكة الإنترنت سسيكسف20.
- تحميل ملفات CSV المصدرة.
- اختيار مراقبة ارتفعت في الجيش الملكي النيبالي كمراقبة إيجابية. قم بإزالة أي خلية الذي يحتوي على عنصر تحكم CT الحمض النووي الريبي أعلى من 25. تطبيع البيانات للتعبير الوسيط لمراقبة الجيش الملكي النيبالي.
- انقر فوق "هنا--> تحليل". إزالة نورت، نوتيمبلاتي، 10 و 20 من عناصر الخلية في استبعاد خيار خلية.
- كتلة الخلايا مع النهج التجميعي الاختيار مع العدد المتوقع من المجموعات. قيم الصادرات التي تم تحليلها.
10-فهرس الفرز التحليل
- نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل البرمجيات المفتوحة وتحميل العينات مفهرسة.
- فتح محرر البرامج النصية وقم بتشغيل البرنامج النصي متاح من كوين J. et al. 21
- الآن أنه ينبغي جعلت البرنامج تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية بوابة لكل خلية واحدة، افتح محرر تخطيط ولون الخلايا وفقا لهذا التجمع من سسيكسف (متوفرة في الملف المسمى "Sample_complete_Data.xls").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول وصف سريعة، وتنفيذه بسهولة وموثوق بها للغاية. ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن الإعداد التجريبية. يمكن تنفيذ البروتوكول كاملة، من الفرز من خلايا مفردة، إلى التضخيم مستهدفة محددة، وقياسات التعبير الجيني وتحليل أولى في غضون ثلاثة أيام. مثال على تحليل النتائج في شكل خريطة الحرارة التي تمثل البيانات الأولية التي تم تحليلها من تحليل التعبير الجيني خلية واحدة استخدام 96 كبسولة تفجير وخلايا 96 من أما مريض سرطان الدم النقوي مزمن (CML) أو خلايا 96 من المسنين-مطابقة صحية ويرد في الشكل 2عنصر التحكم. استخدام المجموعات الهرمية، يمكن تقسيم الخلايا تم تحليلها إلى أربع مجموعات فرعية استناداً إلى توقيعاتهم التعبير الجيني. الحرارة خريطة التصور هو وسيلة مريحة للحصول على لمحة عامة عن البيانات، وكذلك فيما يتعلق بمراقبة للآبار التي ينبغي استبعادها من التحليل (مثلاً، التحكم في الآبار). الشكل 2B تحليل عنصر الرئيسي (PCA) تصور كيف مماثلة الخلايا من كل مجموعة إلى بعضها البعض باستخدام الحد من البعد. هنا، يتم تمييزها بسهولة عن باقي الخلايا المتطرفة. لتحليل كيفية الجينات الفردية موزعة فيما بين المجموعات وكذلك تختلف فيما بينها، قطع كمان مفيدة. تظهر في الشكل 2، التعبير عن الجينات الممثل أربعة: الجينات الانصهار المركز-ABL1، الذي يمثل كافة الخلايا ليوكيميك؛ mKI67 ماركر دورة الخلية، التي يعبر عنها في مجموعة فاصل بفعالية؛ علامة تمييز النقوي الخطة الرئيسية للعمليات، الذي يقتصر على ركوب الفريق الفرعي؛ وأخيراً مجلس النواب حفظ الجينات RPS18، التي يعبر عنها في كافة الخلايا. وأخيراً، في 2D الرقم قد تم مترابطة التواقيع الجزيئية إيمونوفينوتيبيد، كالهوية لكل خلية في كل مجموعة تستخدم للون الخلايا الفردية في مؤامرة نظام مراقبة الأصول الميدانية التي تم إنشاؤها من الفهرس الفرز. سيظهر هو تعبير خلية علامة السطحية للخلايا الجذعية المكونة للدم علامات CD90 و CD45RA في هذه الحالة يمكن استخدامها التمييز بين بعض المجموعات وعزلها مستقبلي للتحليل الوظيفي.
ميكروفلويديكس المستخدمة لأداء قبكر خلية واحدة حساسة جداً لإدخال الهواء أو الجزيئات في النظام. ولذلك، من المهم القيام بفحص جودة وظيفة تشغيل للبيانات. ويبين الشكل 3 الممثل تشغيل البيانات والتناقض بين نجاح وفشل بسبب تحميل عينة الفقراء. ويبين الشكل 3 ألف كيف نجحت مستويات روكس بعد نجاح تشغيل انتشار بالتساوي على جميع الآبار الاطمئنان أن التحميل. وفي المقابل، يوضح الشكل 3B كيف فشلت العينة وتحميل المقايسة كما يتبين من عدم وجود روكس في أجزاء كبيرة من الرقائق. مرة واحدة وقد تم تقييم نوعية روكس، يمكن تقييم نوعية إشارات التعبير الجيني الخام. ويرد في الشكل 3، خريطة حرارة لتشغيل ناجحة، حيث التعبير بالتساوي ينتشر عبر عينات مع إشارة قوية من جميع أنحاء 7-25 Ct:s. في المقابل، الشكل 3D يعرض خريطة حرارة لتشغيل فشل فيها كثير من العينات أي إشارة أو التعبير عن كمية محدودة جداً من الجينات. النتائج في الشكل 3D من المحتمل بسبب خطأ في نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز قبل تحليل التعبير الجيني خلية واحدة، نظراً للعديد من الخلايا إشارات التعبير واضحة بينما البعض الآخر عدم التعبير تماما. وأخيراً، يعرض 3E الشكل منحنى التضخيم المتوقع ارتفعت في مراقبة الحمض النووي الريبي مع جميع الآبار بعد تعبيراً واضحا عن حوالي 10 قيراط مع قليل من لا تباين. عنصر التحكم هذا إيجابية تدابير كفاءة جميع الخطوات في التحليل قبكر خلية واحدة. للتأكد من أن التضخيم داخل النطاق الديناميكي، أرقام خلية مختلفة مدرجة بوصفها عناصر التحكم الخطي؛ هنا، يتم استخدام عناصر تحكم الخلية 10 و 20. CT الاختلافات بين عناصر التحكم الخطي ينبغي أن تعكس الاختلافات في أرقام الخلية. وأخيراً، لا من النسخ العكسي (نورت) وعناصر القالب السلبي لا ضمان أن اكتشاف لا إشارات إيجابية كاذبة من الجينوم الحمض النووي أو التلوث، على التوالي.
رقم 1: عرض التخطيطي للبروتوكول. خلايا ملطخة، فرز مع تطبيق الفرز الفهرس المنشط لتسجيل التعبير علامة السطحية، وتفكيك لإطلاق سراح مرناً. مرناً عكس بعد نسخها إلى كدنا وتضخيم استخدام التضخيم مستهدفة محددة. بعد ذلك، يتم تحميلها العينات في رقاقة موائع جزيئية، جنبا إلى جنب مع الإشعال الفردية حيث الشخصية التعبير الجيني لكل خلية يتم تحليلها باستخدام الرايت qPCR. بعد جمع البيانات والبيانات المجهزة مسبقاً لإزالة الخلايا ذات نوعية متدنية والتجميع تتم لتعريف السكان الخلية جزيئيا متميزة. وأخيراً، ترتبط جزيئيا تعريف الفئات السكانية الفرعية للتعبير علامة السطحية من نظام مراقبة الأصول الميدانية فهرس الفرز البيانات إلى إيمونوفينوتيبيكالي تميز عدم تجانس السكان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: يحلل نتائج تمثيلية الثلاث الناجحة وحيدة الخلية الجينات التعبير العادي وليوكيميك من الخلايا الجذعية المكونة للدم. (أ) الحرارة خريطة عرض خلية واحدة الجينات القياسات التعبير من خلايا مفردة 270 من مريض سرطان الدم النقوي المزمن، فضلا عن عنصر تحكم صحية تطابق العمر تحليلها بواسطة تجميع التسلسل الهرمي باستخدام سسيكسف 18، أداة تحليل مصممة لهذا النوع من البيانات. الأحمر يمثل التعبير عالية، والتعبير منخفض الأزرق والرمادي أي تعبير. تم تقسيم الخلايا إلى أربع مجموعات مختلفة استناداً إلى توقيعاتهم التعبير الجيني. ويتضح من البيانات أن يمكن تقسيم السكان ليوكيميك من الخلايا الجذعية من هذا المريض في أحد السكان هادئة (المجموعة 3)، مع التعبير عن إلا عدد قليل من علامات التمايز، وواحد للسكان بنشاط تقسيم الشروع فيها بالتعبير عن الجينات المرتبطة بالتمايز النقوي (المجموعة 4). البيانات المستخدمة هنا من مريض محدد ضمن الأعمال المنشورة سابقا قبل وارففينجي et al. 22 (ب) الرئيسية يمكن أن يظهر تحليل مكون (PCA) للبيانات المعروضة في A، حيث فصل أربع مجموعات. كمان (ج) قطع الجينات الأربعة مع الكتلة تعبيراً محدداً، بنك ABL1، mKI67، RPS18، والخطة الرئيسية للعمليات. يمثل كل الأرض كمان التعبير في كل مجموعة والخط المنقط عبر القيمة الوسطية للتعبير لكافة الخلايا. (د) تحليل فهرس الفرز لواحدة من عينات المرضى ممثلة في خريطة الحرارة، حيث يتميز كل خلية فردية مع لون ما يتدنى الجزيئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ضوابط الجودة من qPCR متعدد في الوقت الحقيقي البرمجيات PCR. (أ) الصورة روكس تحميل نموذج ناجح وتحميل المقايسة. تحميل صورة من نماذج غير ناجحة والمقايسة تحميل روكس (ب)، حيث أظهرت أحمال فاشلة لعينات نقص روكس في خطوط أفقية. وسوف سيظهر التحميل الفاشلة لفحوصات في خطوط عمودية. (ج) مثال لنجاح تشغيل في عرض خريطة الحرارة، حيث خلايا مفردة تمثل الصفوف والجينات تمثل الأعمدة. ويشير التعبير الجيني عالية التعبير الصفراء، وانخفاض في الزرقاء وليس التعبير تم الكشف عنها باللون الأسود. (د) مثال على فشل تشغيل في عرض خريطة الحرارة، حيث خلايا مفردة تمثل الصفوف والجينات تمثل الأعمدة. يتم تمثيل التعبير الجيني عالية باللون الأصفر، يمثلها التعبير منخفض الأزرق، وليس التعبير تم الكشف عنها باللون الأسود. (ﻫ) "تطبيع كثافة" (يسار) وارسم التضخيم (يمين) لعنصر تحكم الجيش الملكي النيبالي ارتفعت. تبين ct-القيم حوالي 10 والمنحنيات مع اختلاف محدود ناجحة وقوية عكس النسخ وتضخيم ما قبل قبكر تحليل داخل جميع الآبار. (و) تطبيع كثافة (يسار) وارسم التضخيم (يمين) الجينات الفاشلة. كثافة طبيعية لا تشكل منحنى والمؤامرة التضخيم يظهر طفرات كبيرة في الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفي السنوات الأخيرة، أصبح تحليل التعبير الجيني خلية واحدة إضافة قيمة لتعريف عدم تجانس السكان خلية مختلفة23. ظهور التكنولوجيات تسلسل الحمض النووي الريبي نظرياً يوفر إمكانية قياس الترنسكربيتوم كامل من خلية، لكن هذه الأساليب هي تعقدت الاختلافات في أعماق تسلسل خلية إلى خلية، والمنقطعين عن الدراسة. قبكر خلية واحدة يقدم تحليلاً حساسة وقوية للتعبير عن مئات جينات الحرجة حيث كافة الخلايا تعامل بالمثل، الحد من الضوضاء التقنية. بالإضافة إلى ذلك يسمح التحليل تركيزاً على عدد محدود من النسخ لتحليل مبسط دون تدخل من الجينات الغاية المعلنة.
نظراً للنهج الذي يحقق فقط مجموعة فرعية جينات التي أعرب عنها في الخلايا من المهم جداً لاختيار المجموعة من الجينات الصحيحة عند تصميم لوحة الجينات. يمكن أن يتم اختيار الجينات في العديد من الطرق؛ عن طريق الأدب، والنتائج السابقة بتحليل الجملة، والمعلوماتية الحيوية في تحليل البيانات المتاحة للجمهور. وهذه ليست تافهة؛ ومع ذلك، مع المجموعة من الجينات الصحيحة يمكن أن النهج قوية جداً. عندما تم تصميم لوحة الجينات، من المهم التحقق من أن كبسولة تفجير هي عدم التدخل أثناء الإرسال المتعدد. هنا نوصي تحليل إذا الخطية كبسولة تفجير واسطة preforming سلسلة تمييع مع مادة وافرة؛ الرقم إضعاف مجموعة من الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة هو مبين في تكميلية 2D في وارففينجي et al. 22
القيود الرئيسية اثنين من البروتوكول المعروضة هنا هي عدد محدود من الخلايا والجينات بالتحقيق. ومع ذلك، حتى ولو الخلايا فقط 96 هي التحقيق في كل تشغيل، هذا البروتوكول بسيطة نسبيا يمكن أن تكتمل في يوم واحد وبالتالي يمكن تحليل مئات خلايا في أسبوع واحد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة عدد الجينات التحقيق إذا لم يتم تضمين المزيد من الإشعال في الخطوة ما قبل التضخيم محددة الهدف. وفي هذه الحالة، يلزم رقائق عدة للتحقيق في كل مجموعة من الإشعال 96.
إذا شديدة التعبير عن الجينات أو الخلايا التي تحتوي على المحتوى العالي من الجيش الملكي النيبالي، ويجري تحليل، ينبغي تعديل عدد دورات الأمثل للخلايا الجذعية المكونة للدم مع التعبير الجيني عموما منخفضة23 . تغيير دورات التضخيم مهم أيضا عند التحقيق في معظم السكان. لتحليل الجزء الأكبر من الخلايا الجذعية المكونة للدم (خلايا 100) نوصي بتخفيض مقدار التضخيم قبل دورات من 25 إلى 18.
الأسباب الأكثر شيوعاً لفشل تشغيل يرجع الفرز غير ناجحة لخلايا مفردة في البئر لصفيحة تحلل، فرز الخلايا غير قابل للحياة أو دون المستوى الأمثل قبل التضخيم أو رقاقة فشل تحميل. مستوى روكس في كل دائرة رد الفعل مؤشر على تحميل نموذج أو المقايسة، وإذا هذه منخفضة، فمن المستحسن إعادة تشغيل بعض العينات على شريحة جديدة، منذ روكس انخفاض مستويات ناجمة على الأرجح عن إدخال فقاعات أثناء التحميل. عدم مراقبة ارتفعت في الجيش الملكي النيبالي التعبير مؤشر على أن فشلت قبل الامبير، يرجح أن سبب القضايا مع التضخيم السابقة-أو عكس النسخ الكواشف. وفي هذه الحالة، من المستحسن أن يتم تشغيل شريحة جديدة مع كواشف مختبر جديد وخلايا مفروزة حديثا. الكشف عن مراقبة الجيش الملكي النيبالي ولكن أي إشارة إلى تعبير الجينات الأخرى إشارات مؤشرا على فشل نظام مراقبة الأصول الميدانية وحيدة الخلية الفرز قبل تحليل التعبير الجيني. لتجنب الأخطاء أثناء الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية من المهم ضمان أن يتم فرز الواحد-الخلايا داخل المركز من كل بئر. يمكن أن يتم هذا بفرز الخرز في صفيحة فارغة ويتفقد بصريا حيث الأراضي الحبرية. تأكد من أن نوع الاختبار في جميع الآبار في حواف اللوحة التأكد من أن طريقة إعداد غير صحيحة للآبار القليلة الأولى فقط. وعند الاقتضاء، خلايا مفردة يمكن بالتوازي مع فرز للنمو في المختبر وتحليل مسبق لتحليل قبكر لعنصر التحكم للبروتوكولات الفرز ناجحة. فهرس فرز المعلومات لا تسمح إلا للتحقيق في إيمونوفينوتيبيد يتدنى جزيئيا متميزة ولكن يمكن أيضا أن توفر معلومات مفيدة عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها، إذا كنت تقوم بالفرز سكان غير معرف، والعديد من الخلايا ذات الجودة المنخفضة في تحليل التعبير الجيني خلية واحدة. يمكن استخدام المعلومات فهرس الفرز تحسين استراتيجية النابضة وتجنب الفرز المستقبلية انخفاض نوعية الخلايا.
تحليل التعبير الجيني خلية واحدة ثورة الخلية غير متجانسة كيف يتم التحقيق في السكان ويمهد الطريق للمزيد من فهم تمايز الخلية. وقد استخدمت تحليل التعبير الجيني خلية واحدة في هايماتوبويسيس، صقل الاستراتيجيات الفرز لمجموعات فرعية من هسكس7، لحل عدم تجانس السلف multipotent السكان6،،من2425 ، وتحديد العلاج بالخلايا الجذعية ليوكيميك متحسسة للسكان22،26. مزيج من فهرس الفرز مع كل تعبير الجينات خلية واحدة-والتحليل الوظيفي قد ثبت سابقا أن تكون موثوقة وفعالة عند التحقيق في إيمونوفينوتيبي وعدم تجانس السكان المختلفة27، 28،29. هنا، وهو نهج للتحقيق من الجزيئية ووصف التغاير إيمونوفينوتيبيك من الخلية التي كان السكان فيها الجمع بين قبكر خلية واحدة مع فهرس الفرز تمكن نتائج سريعة واستنساخه بدون تحليل معقدة في فترة قصيرة الإطار الزمني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل معتمد من المنح المقدمة من الجمعية السويدية لمكافحة السرطان، ومجلس البحوث السويدية، المجتمع السويدي للأبحاث الطبية، ومؤسسة سرطان الطفولة السويدية، راغنار سودربيرغ المؤسسة، وكنوت ومؤسسة والنبرغ أليس
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
- Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
