Summary
Bulk genet uttrykk målinger Sky enkeltcelle forskjeller i ulike celle populasjoner. Her beskriver vi en protokoll for hvordan encellede gene expression analyse og indeks sortering av Florescence aktivert celle sortering (FACS) kan kombineres for å avgrense heterogenitet og immunophenotypically karakterisere molecularly ulike celle populasjoner.
Abstract
Immunophenotypic karakterisering og molekylære analyse har lenge vært brukt til å avgrense heterogenitet og definere ulike celle populasjoner. FACS er iboende en enkeltcelle analysen, men før molekylær analyse, målcellene er ofte prospektivt isolert i bulk, og dermed miste encellede oppløsning. Encellede genet uttrykk analysen gir et middel til å forstå molekylær forskjellene mellom enkeltceller i ulike celle populasjoner. I bulk celle analyse resulterer en overrepresentation av en distinkt celle type i skjevheter og occlusions av signaler fra sjeldne celler med biologisk betydning. Ved å benytte FACS indeks sortering sammen til én celle gene expression analyse, befolkninger kan undersøkes uten tap av encellede oppløsning mens celler med middels cellen overflaten markør uttrykk er også tatt, slik at evaluering av relevansen av kontinuerlig overflaten markør uttrykk. Her beskriver vi en tilnærming som kombinerer encellede omvendt transkripsjon kvantitative PCR (RT-qPCR) og FACS indeks sortering samtidig betegner den molekylære og immunophenotypic heterogenitet i celle populasjoner.
I motsetning til én celle RNA sekvensering metoder tillater bruk av qPCR med spesifikt mål forsterkning for robust målinger av lav-overflod utskrifter med færre utfall, mens det ikke er forvirret av spørsmål knyttet til celle til celle variasjoner i Les dybde. Videre innrømmer av direkte indeks-sortering single-celler til lysis bufre denne metoden, for cDNA syntese og bestemt mål før forsterkning utføres i ett trinn så vel som for korrelasjon av senere avledede molekylær signaturer med celleoverflaten markør uttrykk. Beskrevet tilnærming er blitt bebygget å undersøke blodkreft single-celler, men har også blitt brukt med hell på andre celletyper.
Avslutningsvis gir tilnærming beskrevet her sensitive måling av mRNA uttrykk for et panel for forhåndsvalgt gener med mulighet for påfølgende potensielle isolering av molecularly distinkte subpopulasjoner å utvikle.
Introduction
Hver blod celle antas å ligge i en mobilnettet hierarki, der stamceller danne toppen på en rekke stadig forpliktet mellomliggende progenitors som til slutt terminalt skiller ut de endelige effektor cellene med bestemte biologiske funksjoner1. Mye av kunnskap om hvordan stamcelleforskningen systemer er organisert er generert i blodkreft systemet, hovedsakelig på grunn av muligheten til å isolere prospektivt distinkte blodkreft bestander høyanriket stamceller eller ulike progenitors2 av FACS sortering. Dette har tillatt for mange av disse befolkningene som skal analyseres funksjonelt eller molecularly, hovedsakelig gjennom gene expression profilering3,4. Men når analysere genuttrykk av bulk bestander individuelle forskjeller mellom celler er gjennomsnitt og tapte5. Således, manglende evne til å oppdage celle til celle variasjoner i heterogene celle fraksjoner kan forvirre vår forståelse av viktige biologiske prosesser hvis små undergrupper av celler konto for tiltenkt biologiske funksjonen til at befolkningen6, 7. Derimot undersøkelse av genuttrykk signaturer encellede oppløsning tilbyr en mulighet til å avgrense heterogenitet og omgå altoverskyggende påvirkninger fra overrepresentert delsett av celler8.
Hittil har blitt utviklet mange protokoller for enkeltceller gene expression analyse; med begge fremgangsmåtene har sine egne begrensninger. Den første metoden var RNA fluorescerende i situ hybridisering (RNA-fisk), som måler et begrenset antall utskrifter for en tid, men er unik ved at den tillater undersøkelse av RNA lokalisering9,11. Tidlige metoder bruker PCR og qPCR for å oppdage en enkelt eller svært få transkripsjoner ble også utviklet12. Men har disse i det siste blitt erstattet av microfluidics-baserte metoder som kan samtidig analysere uttrykk for hundrevis av transkripsjoner per celle i hundrevis av celler gjennom qPCR og dermed kunne høy-dimensjonale heterogenitet analyse bruke forhåndsbestemt genet panel10,13. Nylig RNA sekvensering-baserte teknologier har blitt mye brukt for enkelt celle analyse, dette teoretisk kan måle det hele transcriptome av en celle og dermed legge en utforskende dimensjon til heterogenitet analyse10, 14. Multiplexed qPCR analyse og encellede RNA sekvensering har ulike funksjoner, derfor begrunnelsen for å bruke en av metodene er avhengig av spørsmålet spurte samt antall celler i målgruppen. Høy gjennomstrømming og lav kostnad per celle med objektiv, utforskende kjennetegner encellede RNA sekvensering er ønskelig når ukjent celle eller store populasjoner er undersøkt. Imidlertid er encellede RNA sekvensering også forutinntatt mot sekvensering høy rikelig transkripsjoner oftere mens utskrifter med lav overflod er utsatt for brudd. Dette kan føre til betydelig komplekse data som setter høye krav på bioinformatic analyse å avsløre viktig molekylær signaler som er ofte subtile eller skjult i teknisk støy15. Dermed for godt karakterisert vev, encellede qPCR analyse bruker forhåndsbestemt primer paneler valgt for funksjonelt viktig gener eller molekylære markører kan tjene som en sensitiv, enkel tilnærming til å bestemme heterogenitet av en befolkningen. Men det bør bemerkes at i forhold til én celle RNA-seq, kostnaden per celle er generelt høyere for én celle qPCR metoder. Her beskriver vi en tilnærming som kombinerer encellede RT-qPCR (endret fra Teles J. et al. 16), FACS indeksen sortering17 og bioinformatikk analyse-18 for å samtidig karakterisere den molekylære og immunophenotypic heterogenitet i populasjoner.
I denne cellen befolkningen av interesse er farget og enkelt-celler er sortert etter FACS direkte i lyseringsbuffer i 96-brønnen PCR plater. Samtidig registreres uttrykk nivåene av et ekstra sett med celle-overflate markører for hver eneste celle under FACS-sortering, en metode som kalles indeks-sortering. Lysed celle materialet forsterkes senere og gene uttrykk for et utvalgt sett av gener analysert med RT-qPCR, bruk en microfluidic plattform. Denne strategien kan molekylær analyse av sorterte encellede samt samtidige karakterisering av hver enkelt celle celle-overflate markør uttrykk. Ved å direkte tilordne molecularly forskjellige undergrupper av celler til uttrykk for den indekserte sorterte markører, kan subpopulasjoner være knyttet til en bestemt immunophenotype som kan brukes for deres potensielle isolasjon. Metoden er beskrevet trinn for trinn i figur 1. Et forhåndsbestemt genet panel ytterligere bidrar til en høyere oppløsning av de målrettede genuttrykk, siden det omgår måling av irrelevante rikelig gener som kan ellers occlude subtile gene expression signaler. Videre gir det spesifikt mål forsterkning, ett trinn omvendt transkripsjon og forsterkning robust måling av lav uttrykt transkripsjoner, som transkripsjonsfaktorer eller ikke-poly-adenylated RNAs. Viktigst, kan qPCR metoder for måling av mRNA fra fusion proteiner, noe som er viktig i undersøker visse maligne sykdommer19. Til slutt fokuserte antall gener undersøkt, lav skolegangen, og begrenset tekniske forskjellene mellom celler gjør denne metoden lett analysert i forhold til høyere-dimensjonale metoder, for eksempel encellede RNA-seq. Ved å følge protokollen, kan et hele eksperiment utføres, sortering celler til analysert resultatene, innen tre dager, noe som gjør dette til en ukomplisert og rask metode for følsom, høy gjennomstrømming encellede gene expression analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Lysis plater
- Bruke en RNA/DNA gratis benk, forberede nok lyseringsbuffer 96 brønner med 10% ekstra, ved å blande 390 µL nuclease gratis vann, 17 µL av 10% NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0.1 M DTT og 5,3 µL RNAse hemmer (se Tabell for materiale). Vortex og rotere ned.
- Distribuere 4 µL av lyseringsbuffer hver brønn av en 96 godt PCR plate og forsegle platene med selvklebende folien. Nedspinning rør å samle væske nederst på platene. Oppbevare platene på is til celle sortering (maksimalt 24 h).
2. forberedelse av cellene til cellen sortering
- Tine riktig antall celler (her, CD34 beriket blodkreft stilk og progenitor celler) for eksperimentet. 1 x 106 celler er aktuelle for sortering ca tre 96-brønns plater av enkelt-celler med kontroller.
- Overføre tinte celler slik 15 mL koniske og legge 1 mL FBS hver 30 s til et totalt volum på 8 mL er nådd. Spinn celler i en centrifuge 350 x g for 10 min på 4 ° C og fjerne nedbryting.
- Resuspend celler i 8 mL flekker buffer (PBS med 2% FBS) og sentrifuge 350 x g i 10 min på 4 ° C og fjerne nedbryting.
- Resuspend celler i 200 µL flekker buffer og fjerne celler for kontroll flekker.
- Gjøre fluorescens minus én kontroller (FMOs) for hver fluorophore, ved flekker en brøkdel av celler i 50 µL flekker buffer. I dette eksemplet brukes 6 microcentrifuge rør med 20.000 celler som FMOSs. Merk at antall celler bør justeres avhengig av befolkningen undersøkt. Legge alle antistoffer på samme konsentrasjonen som eksempel flekken bortsett fra én til hver rør.
- Gjøre enkelt flekker for hver fluorophore ved flekker en brøkdel av celler i 50 µL buffer for hver fluorophore som brukes. I dette eksemplet brukes 6 microcentrifuge rør med 20 000 celler. Merk at målet for hver antistoff må uttrykkes av cellene som brukes for kontroller. Legge til hver antistoff på samme konsentrasjonen som eksempel flekken i individuelle rør. I tillegg holde 20.000 unstained kvinne celler i 50 µL som en unstained kvinne kontroll.
- Cellen prøven, legge antistoffer på deres aktuelle konsentrasjon. Brukte her er CD34-FITC på en 1/100 konsentrasjon, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 og avstamning blanding: CD3-PECy5 1/50 CD2-PECy5 1/50 CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, og CD235a-PECy5 1/1000.
- Inkuber celler med antistoffer i 30 min på isen i mørket.
- Vask celler med 3 mL flekker buffer. Sentrifuge cellene på 350 x g i 10 min på 4 ° C og fjerne nedbryting.
- Gjenta trinn 2.9 resuspend celler.
- Resuspend prøven i 500 µL og FMOs i 100 µL flekker buffer med 1/100 7AAD og filter celler gjennom en 50 µm å få en enkeltcelle suspensjon.
3. celle sortering
- Kontroller at FACS maskinen er satt opp riktig med drop forsinkelse og cytometer installasjon og sporing (CST) som nylig er utført i henhold til produsentens instruksjoner, slik at de aktuelle cellene er sortert. Bruk av 85 mikron munnstykke og maksimal hastighet 4 anbefales for blodkreft cellene, mens optimal hendelsen er mellom 800 og 2000 hendelser/s.
- Korrigere spectral overlapping ved å utføre fluorescens kompensasjon og angi gates etter FMO kontroller eller negativ internkontroll.
- Utføre reanalysis av målgruppen ved sortering minst 100 målcellene i en ny microcentrifuge rør med 100 µL flekken bufferen. FACS analysere sorterte cellene ved sorterte prøven og sørge for at de havner i Sorter porten.
- Oppsett enkelt celle plate sortering etter sentrering fall i godt A1 i en 96 godt plate. Når det er sentrert, kan du sortere 50-100 6 µm partikler i alle brønnene rundt kanten av en tom 96 godt plate å sikre at alle brønnene får en celle i midten av hver brønn.
- Hvis mulig, kan en ekstra kontroll for å sikre at levedyktige cellers sorteres legges ved sortering single-celler for vekst i vitro . Haematopoietic celler kan dyrkes i U-bunn 96 bra plater i 100 µl SFEM med 1% penicillin streptomycin, 100 ng/mL FLT3L, TPO og SCF. Analysere hver brønn etter 3 dager i kultur for cellen kolonier ved hjelp av et mikroskop.
- Fjern lim fra platene. En enkeltcelle slags interesse (her Lin-CD34 + CD38-celler) i 92 av 96 brønnene, aktivere indeks-sortering i FACS sortering programvare lagre immunophenotypic profilen for andre markører av interesse (her CD45RA, CD49f og CD90) for hver enkelt celle.
- Sortere to brønner med 10 og 20 celler for linearitet kontroller i PCR forsterkning. Wells H1 og H2 brukes vanligvis.
- Holde to brønner uten celler som ingen-malen styrer, vanligvis brønner H3 og H4.
- Forsegle platene med klar lim og spinne platene på 300 x g for 1 min før snapin fryser på tørris.
- Lagre frosne plater på-80 ° C.
Merk: Trygt stoppe punktet. Sortert og lysed cellene kan holdes på-80 ° C for langtidslagring.
4. reversere transkripsjon og bestemt mål forsterkning
- Klargjør primer blandingen for alle 96 genet mål ved å legge til 2 µL i hvert primer, inkludert housekeeping genet primere og primere for piggete i kontroll RNA, i en 1,5 mL RNAse gratis tube på en RNA/DNA gratis benk. Hvis bruker mindre enn 96 primere, legge en tilsvarende mengde nuclease gratis vann for manglende primerne. Primere er bestilt separat tilsvarer ønsket genet panelet.
- Gjøre omvendt transkripsjon og bestemt mål forsterkning blande ved å legge 632.5 µL 2 x reaksjonen blanding, 101.2 µL Taq/SuperscriptIII, 151.8 µL Primer mix og 0,7 µL piggete kontroll RNA. Preform dette trinnet på en DNA gratis benk. Blanding av vortexing og spinn ned samle væske i bunnen av røret. Hold på is inntil tillegg til prøven.
- Gjør no-revers transkripsjon kontroll blanding fire brønner ved å blande 27.5 µL av 2 x reaksjonen blanding, 1.76 µL av Taq enzym, 6.6 µL av primer og 2.64 µL nuclease gratis vann. Spike kontroll RNA. Utføre dette trinnet på en DNA gratis benk. Vortex og spinn ned samle væske i bunnen av røret og holde på is inntil tillegg utvalg.
- Tine lysate plater på is. Legge til 8.75 µL av tidligere forberedt omvendt transkripsjon og bestemt mål forsterkning blanding 92 brønner, inkludert linearitet og ingen-mal kontrollene. Legge til 8.75 µL av nei-revers transkripsjon kontroll fire gjenværende brønnene. Forsegle plater med klar lim og spinn ned samle væske nederst på platene.
- Preform omvendt transkripsjon og bestemt mål forsterkning ved å kjøre platen i en PCR maskin etter preamp programmet; Trinn 1:50 ° C for 60 min, trinn 2: 95 ° C i 2 minutter, trinn 3: 95 ° C for 15 s, trinn 4: 60 ° C i 4 min, Gjenta trinn 3-4 24 ganger og til slutt steg 5: 8 ° C alltid.
- Når PCR er fullført, kan du holde platen på 8 ° C for kortsiktige lagring og 20 ° C for langtidslagring.
Merk: Trygt stoppe punktet. Forsterket materiale kan holdes på 8 ° C for kortsiktige lagring og 20 ° C for langtidslagring.
5. utarbeidelse av prøven og analysen plater for Multiplex Microfluidic Gene Expression analyse
- Forberede analysen lasting plate av pipettering 3 µL analysen lasting reagens til hver brønn av en 96 godt plate. Legge til 3 µL av hver primer individuelle brønner i analysen lasting plate.
- Forsegle plate med lim og spinn ned samle væske nederst på platene.
- Forberede fortynning plate av pipettering 8 µL av nuclease gratis vann i alle brønner av en 96 godt plate. Legge til 2 µL av forsterket prøve fortynning platen, gjør en siste fortynning av 1:5.
- Sel plate med lim, blande av vortexing plate for 10 s, og endelig spinne ned samle væske nederst på platene.
- Klargjør eksempel lasting blandingen ved å blande forsiktig 352 µL av master mix med 35,2 µL av prøven lasting reagensen. Forberede prøven lasting plate av aliquoting 3.3 µL av lasting blanding i hver brønn av en 96 godt plate.
- Legge til 2,7 µL fra utvannet eksempel i hver brønn av utvalget lasting plate.
- Forsegle plate med lim og spinn ned samle væske nederst på platene.
6. lasting av Microfluidic Chip
- Ta ut en ny 96 x 96 microfluidic chip. Klargjør viker ved poking dem med en sprøyte med cap på å sørge for at de kan flyttes.
- Fjern bobler fra sprøyter. Legge til hele volumet av sprøyter hver ventil mens vippe chip 45 grader og trykke ned ventilen. Viktigste brikke med IFC-kontrolleren.
- Laste hver vik analysen med 4,25 µL fra hver av brønnene i analysen lasting plate. Unngå bobler. Hvis boblene vises i brønnen, fjerne dem med en pipette tips.
- Fortsetter å laste hver eksempel utløpet 4,25 µL fra hver av brønnene i prøven lasting plate, unngå bobler og hvis boblene vises, fjerner du dem med Pipetter spissen.
- Legg chip IFC kontrolleren.
- Kontroller at chip ser selv, og at alle kamre er lastet. Fjerne støv fra chip overflaten ved å berøre det med tape. Kjør chip i multiplex microfluidic gene expression plattformen.
7. kjøre Chip på Multiplex Microfluidic Gene Expression plattform
- Etter lasting chip i multiplex microfluidic gene expression plattform, navnet prøven.
- Angi ROX passiv fargestoff. Angi enkelt sonde og FAM-MGB som fluorescens. Bruke 96 x 96 standard v2 som protokollen. Starte løpe.
- Fjern chip når kjører er fullført.
8. foreløpig analyse av Chip løpe
- Laster data i Real-Time PCR analyseprogramvare.
- Last genet navn og cellenavn ved å lime cellen og gene oppsett fra en tabulatordelt fil.
- Åpne bilde visning og velg ROX som fargestoff. Sjekk Hvis alle brønnene har ROX passiv fargestoff.
- Undersøke om alle forsterkning tomter ser ok, med glatt forsterkning sving sleik uten pigger (lik figur 3E).
- Sikre at alle enkelt-celler har uttrykk for piggete i kontroll RNA sørge for at alt er lastet riktig.
- Kontroller at alle celler har housekeeping genuttrykk og dermed har blitt sortert riktig.
- Kontroller at 10 og 20 celle linearitet kontrollene har ca 1 CT forskjell å validere lineær forsterkning.
- Kontroller om det er uttrykket i noRT kontroll prøvene. Hvis uttrykk i noRT kan du vurdere å endre sonder til sonder som ikke oppdager genomisk DNA for senere kjøringer.
- Eksportere data i csv-filer for videre analyse.
9. encellede analyse med SCExV
Merk: En innledende film er tilstede20 å innføre verktøyet. Her vises en kort anbefaling om hvordan analyse ved hjelp av kontrollene i protokollen.
- Koble til SCexV nettstedet20.
- Last opp eksporterte CSV-filer.
- Valgte kontrollen piggete i RNA som positive kontroll. Fjerne en celle som har en kontroll RNA CT over 25. Normalisere dataene median uttrykk for kontroll RNA.
- Klikk "her -> analysere". Fjerne noRT, notemplate, 10 og 20 celle kontroller i alternativet utelukke cellen.
- Klynge celler med klynger tilnærming av valget med forventet antall klynger. Eksportere analysert verdier.
10. indeks-sortering analyse
- Åpne FACS analyseprogramvare og laste indekserte prøvene.
- Åpne script editor og kjøre skriptet tilgjengelig fra Quinn J. et al. 21
- Nå som FACS analyseprogramvare burde ha gjort en port for hver enkelt cellene, åpen layout editor og farge cellene i henhold til grupperingen fra SCexV (tilgjengelig i filen som heter "Sample_complete_Data.xls").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet er rask, lett utført og pålitelig. En oversikt over den eksperimentelle set-up vises i figur 1. Hele protokollen, fra sortering av enkelt-celler, bestemt mål forsterkning, gene expression målinger og foreløpig analyse kan utføres i tre dager. Et eksempel på analysert resultatene i form av en varmekart som representerer foreløpige analyserte data fra encellede genet uttrykk analyse med 96 primere og 96 celler fra enten en Kronisk myelogen leukemi (bruk) pasient eller 96 celler fra en alderen-matchet sunn kontrollen vises i figur 2. Bruker hierarkisk klynging, kan analysert cellene deles i fire undergrupper basert på deres genuttrykk signaturer. Den varme kart visualiseringen er en praktisk måte å få en oversikt over data i tillegg til kontroll brønner som skal utelates fra analyse (f.eks kontroll wells). Figur 2B er en viktigste komponenten analyse (PCA) visualisere hvor like cellene i hver gruppe er ved hjelp av dimensjonen reduksjon. Her er outliers lett skilles fra resten av cellene. Å analysere hvordan enkelte gener fordeles blant klyngene samt varierer mellom dem, fiolin tomter er nyttig. Uttrykket av fire representant gener vises i figur 2C,: fusion genet BCR-ABL1, som markerer alle leukemic celler. cellen syklus markør mKI67, som er uttrykt i en aktivt dele gruppe. myeloid differensiering markøren MPO, som er begrenset til sykling undergruppen; og endelig huset holder genet RPS18, som er uttrykt i alle celler. Til slutt, i figur 2D molekylær signaturene har vært korrelert i immunophenotyped, som identiteten til hver celle i hver klynge brukes farge enkeltceller i et FACS plott generert fra indeks-sortering. Vist er cellen overflaten markør uttrykket for blodkreft stamcelletransplantasjon markørene CD90 og CD45RA som i dette tilfellet kan brukes å forskjellsbehandle noen av klynger og prospektivt isolere dem for funksjonsanalyse.
Microfluidics brukes til å utføre én celle qPCR er svært følsomme for innføring av luft eller partikler i systemet. Derfor er det viktig å gjøre stolpe kjøre kvalitetskontroll av data. Figur 3 viser representant data og kontrasten mellom en vellykket og en mislykket kjørt på grunn av dårlig eksempel lasting. Figur 3A viser hvordan Rox nivåer etter en vellykket kjøre spredt jevnt over alle brønnene betryggende at lasting har vært vellykket. Derimot illustrerer figur 3B hvordan prøven og analysen lasting har mislyktes som indikert av mangel på ROX i store deler av chip. Når kvaliteten på Rox har blitt vurdert, kan kvaliteten på rå gene expression signalene evalueres. Figur 3 c, en varmekart vellykket rensing presenteres, der uttrykk er jevnt spredt ut over prøver med sterkt signal på rundt 7 til 25 Ct:s. i kontrast, finne 3D viser et varmekartet av en mislykket kjørt hvor mange prøver har ingen signal eller uttrykk for et svært begrenset antall gener. Resultatene i figur 3D er sannsynligvis pga FACS sortering før encellede gene expression analyse, siden mange celler har klart uttrykk signaler mens andre mangler uttrykk helt. Til slutt, figur 3E viser forventet forsterkning kurven piggete i kontroll RNA med alle brønnene har klart uttrykk for rundt 10 CT med liten eller ingen variasjon. Denne positive kontrollen måler effektiviteten av alle trinn i én celle qPCR analysen. For å sikre at forsterkningen er innenfor dynamisk område, er ulike cellen tallene inkludert som linearitet kontroller; her, brukes 10 - og 20-celle kontroller. CT forskjellene mellom linearitet kontroller bør gjenspeiler forskjeller i cellen tallene. Til slutt, ingen omvendt transkripsjon (noRT) og ingen mal negative kontroller sikre at ingen falske positive signaler oppdages fra genomisk DNA eller forurensing, henholdsvis.
Figur 1: skjematisk visning av protokollen. Celler er farget, sortert med indeks-Sorter programmet aktivert for å registrere overflaten markør uttrykk, og lysed å løslate mRNA. mRNA er senere omvendt transkribert til cDNA og forsterket bruker bestemt mål forsterkning. Deretter prøvene er lastet med personlige primere i microfluidic brikke, der gene expression profilen til hver celle er analysert ved hjelp av RT-qPCR. Etter datainnsamling, dataene som er pre-prosessert å fjerne lav kvalitet celler og klynging utføres for å definere molecularly ulike celle populasjoner. Endelig molecularly definerte subpopulasjoner er korrelert til overflaten markør uttrykk fra FACS indeks sortering data til immunophenotypically karakteriserer heterogenitet av befolkningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant resultater av tre vellykket encellede genuttrykk analyser av normal og leukemic blodkreft stamceller. (A) varme kart som viser encellede gene expression målinger av 270 enkeltceller fra en Kronisk myelogen leukemi pasient samt en alder-matchet sunn kontroll analysert av hierarkiske klynger med SCExV 18, et analyseverktøy designet for denne typen data. Rød representerer høye uttrykk, blå lav uttrykk og grå ingen uttrykk. Cellene ble delt inn i fire ulike klynger basert på deres genuttrykk signaturer. Det er klart fra data at befolkningen leukemic stamceller fra denne pasienten kan deles i en quiescent befolkningen (cluster 3), med uttrykk for bare noen differensiering indikatorer, og et aktivt dele befolkningen som har startet uttrykk for gener tilknyttet myelogen differensiering (cluster 4). Dataene som brukes her er fra en valgt pasient inkludert i tidligere publiserte arbeider av Warfvinge et al. 22 (B) viktigste komponenten analyse (PCA) av dataene som vises i A, der fire atskilt grupper kan vises. (C) fiolin tomter av fire gener med klynge bestemte uttrykk, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 og MPO. Hver fiolin tomten representerer uttrykket i hver klynge og den stiplede linjen over representerer middelverdien av uttrykk for alle celler. (D) indeks-sortering analyse av en pasient prøvene i varmekartet, der hver celle er merket med fargen på sin molekylære subpopulasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kvalitetskontroll av multiplex qPCR i sanntid PCR programvare. (A) Rox innlastingsbilde vellykket eksempel og analysen lasting. (B) Rox innlastingsbilde mislykket utvalg og analysen lasting, der mislykkede belastninger av prøver er vist av en mangel på ROX i vannrette linjer. Mislykkede lasting av analyser ville vises i vertikale linjer. (C) eksempel på en vellykket kjøre i varme kart utsikt, hvor enkelt-cellene representerer rader og gener representerer kolonner. Høy genuttrykk angis i gult, lav uttrykk i blått og ikke oppdaget uttrykk i svart. (D) eksempel på en mislykket kjøre i varme kart utsikt, hvor enkelt-cellene representerer rader og gener representerer kolonner. Høy genuttrykk representeres av gul, lav uttrykk er representert med blå og ingen oppdaget uttrykk som svart. (E) normalisert intensitet (venstre) og forsterkning handlingen (høyre) i en spiked i RNA kontroll. CT-verdiene ca 10 og kurver med begrenset variant angir vellykkede og robuste omvendt transkripsjon, pre forsterkning og qPCR analyse i alle brønnene. (F) normalisert intensitet (venstre) og forsterkning plot (høyre) med et mislykket. De normaliserte intensiteter utgjør ikke en kurve og forsterkning plottet viser stor toppene i fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De siste årene, har encellede gene expression analyse blitt et verdifullt tillegg til å definere heterogenitet ulike celle populasjoner23. Ankomsten av RNA sekvensering teknologi gir teoretisk mulighet til å måle det hele transcriptome av en celle, men disse metodene er komplisert ved celle til celle sekvensering dypet og Signalbortfall. Encellede qPCR tilbyr en følsom og robust analyse av uttrykk for hundrevis av kritiske gener der alle cellene behandles på samme måte å redusere tekniske støy. Fokusert analyse av et begrenset antall utskrifter gir i tillegg forenklet analyse uten innblanding fra svært uttrykt gener.
Siden tilnærming etterforske bare et delsett av gener som er uttrykt i cellene er det svært viktig å velge riktig sett med gener når du utformer genet panelet. Valg av gener kan gjøres på flere måter; gjennom litteratur, tidligere funn av bulk analyse og bioinformatikk analyse av offentlig tilgjengelige data. Dette er ikke trivielt; men med de riktige genene kan tilnærming være svært kraftig. Når genet panelet har blitt designet, er det viktig å validere at primerne ikke virker under multipleksing. Her anbefaler vi analysere hvis grunning er lineær av preforming en fortynning serie med rikelig materiale; en fortynning rekke primere brukt i denne studien vises i supplerende finne 2D i Warfvinge et al. 22
De to viktigste begrensningene av protokollen presenteres her er begrenset antall celler og gener undersøkt. Men selv om bare 96 celler er undersøkt i hvert løp, denne relativt enkel protokollen kan gjennomføres på en dag og dermed hundrevis av celler kan analyseres i en uke. Antall gener undersøkt kan i tillegg øke hvis flere primere er inkludert i mål-spesifikke pre forsterkning trinn. I dette tilfellet for flere sjetonger å undersøke hvert sett med 96 primere.
Hvis svært uttrykt gener eller celler med høy RNA-innhold blir analysert, antall sykluser optimalisert for blodkreft stamceller med lav totale gene expression23 skal endres. Endre forsterkning sykluser er også viktig når undersøke bulk populasjoner. For bulk analyse av blodkreft stamceller (100 celler) anbefales det reduserer pre forsterkning sykluser fra 25 til 18.
De vanligste årsakene til mislyktes kjører er mislykket sortering av enkelt-celler inn i brønnen av lysis plate, sortering av ikke-levedyktige celler, suboptimal pre forsterkning eller chip lasting feil. Rox i hver reaksjon kammer er en indikator for lasting av prøve eller analysen, og hvis disse er lav, anbefales det at prøvene å kjøres på en ny flis, siden lav Rox nivåer sannsynlig skyldes innføringen av bobler under lasting. Mangel på piggete i kontroll RNA uttrykk er en indikator som pre-amper har mislyktes, trolig på grunn av problemer med pre forsterkning- eller reversere transkripsjon reagenser. I dette tilfellet anbefaler at en ny chip kjøres nylig sorterte celler og nye reaktantene. Oppdagelsen av kontroll RNA men ingen indikasjon på andre genuttrykk signaler er en indikasjon på mislykket encellede FACS sortering før gene expression analyse. For å unngå feil under FACS sortering er det viktig å sikre at single-celler er sortert i midten av hver brønn. Dette kan gjøres ved å sortere perler inn en tom plate og visuelt inspisere hvor slippverktøyet lander. Kontroller at test-Sorter i alle brønner i kanten av platen slik at oppsettet ikke er bare riktig for de første få brønnene. Eventuelt single-celler kan parallelt sorteres for i vitro vekst og analysert før qPCR analyse kontroll for vellykket sortering protokoller. Indeks-sortering informasjon tillater ikke bare for å undersøke immunophenotyped av en molecularly forskjellige subpopulasjon, men kan også gi nyttig innsikt når feilsøking hvis du sorterer en udefinert befolkning og mange lav kvalitet celler i encellede gene expression analysen. Indeks-sortere informasjonen kan brukes til å optimalisere gating strategien og unngå fremtidige sortering av lav kvalitet celler.
Encellede genet uttrykk analyse er revolusjonerende hvordan ulike celle populasjoner er undersøkt og banet vei for videre forståelse av celledifferensiering. I haematopoiesis, encellede gene expression analyse har blitt brukt til å finjustere sortering strategier for delsett av HSCs7, for å løse heterogenitet multipotent stamfar bestander6,24,25 , og identifisere terapi ufølsom leukemic stamcelleforskningen bestander22,26. Kombinasjonen av indeks sortering med både encellede gene expression- og funksjonsanalyse har tidligere vist seg å være pålitelig og effektiv når undersøker immunophenotype og heterogenitet ulike befolkningsgrupper27, 28,29. Her, en tilnærming for undersøkelse av molekylære og immunophenotypic mangfold i celle populasjoner er beskrevet der kombinere encellede qPCR med indeks sortering muliggjør rask og reproduserbar resultater uten kompliserte analyser i en kort tidsramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av tilskudd fra svenske Cancer Society, den svenske Research Council, The Swedish Society for medisinsk forskning, den svenske Childhood Cancer Foundation, The Ragnar Söderberg Foundation, og The Knut og Alice Wallenberg Foundation
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
- Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
