Summary
Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l'indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.
Abstract
Immunophenotypic caratterizzazione e l'analisi molecolare sono stati utilizzati a lungo per eterogeneità di delineare e definire popolazioni distinte delle cellule. FACS è intrinsecamente un'analisi unicellulare, tuttavia prima di analisi molecolare, cellule bersaglio sono spesso prospetticamente isolate all'ingrosso, perdendo così la cella singola ad alta risoluzione. Analisi dell'espressione genica di singola cellula fornisce un mezzo per capire le differenze molecolari tra le singole celle in popolazioni eterogenee delle cellule. In analisi di massa cellulare una sovrarappresentazione di un tipo di distinte delle cellule provoca pregiudizi e occlusioni dei segnali dalle cellule rare con importanza biologica. Utilizzando FACS Indice ordinamento accoppiato all'analisi dell'espressione genica di singola cellula, popolazioni possono essere indagate senza perdita di risoluzione di singola cellula mentre le cellule con espressione di superficie dell'indicatore delle cellule intermedie vengono inoltre acquisite, consentendo la valutazione dei la rilevanza dell'espressione dei marker di superficie continua. Qui, descriviamo un approccio che combina cella singola trascrizione d'inversione quantitativa PCR (RT-qPCR) e FACS Indice ordinamento contemporaneamente caratterizzazione molecolare e immunophenotypic eterogeneità all'interno di popolazioni cellulari.
Contrariamente ai metodi di sequenziamento di cella singola del RNA, l'uso di qPCR con amplificazione del target specifico permette per misurazioni robusti di basso-abbondanza trascritti con meno interruzioni, mentre non è confuso da questioni legate alle variazioni della cellula--cellula in lettura profondità. Inoltre, da direttamente questo metodo buffer indice-ordinamento single-cellule in Lisi, permette per la sintesi del cDNA e target specifico pre-amplificazione per essere eseguite in un unico passaggio anche per quanto riguarda la correlazione delle firme molecolari successivamente derivate con superficie cellulare espressione del marcatore. L'approccio descritto è stato sviluppato per indagare su singolo-cellule ematopoietiche, ma inoltre sono stati usati con successo su altri tipi di cellule.
In conclusione, l'approccio descritto nel presente documento consente una misura sensibile dell'espressione di mRNA per un pannello di geni pre-selezionati con la possibilità di sviluppare protocolli per successivo isolamento futuri dei molecolarmente distinte sottopopolazioni.
Introduction
Ogni singola cellula del sangue è creduto di risiedere in una gerarchia cellulare, dove le cellule staminali formano l'apice in cima a una serie di sempre più progenitori intermedi che alla fine terminalmente differenziarsi nelle cellule effettrici finale che trasportano specifici funzioni biologiche1. Molte delle conoscenze su come sono organizzati i sistemi di cellule staminali è stato generato nel sistema ematopoietico, in gran parte a causa della capacità di isolare prospetticamente distinte popolazioni ematopoietiche altamente arricchiti per le cellule staminali o vari progenitori2 ordinando FACS. Questo ha permesso per molti di queste popolazioni di essere analizzato funzionalmente o molecolare, principalmente attraverso profili di espressione genica3,4. Tuttavia quando l'analisi di espressione genica delle differenze individuali di popolazioni di massa tra cellule sono mediati e perso5. Così, incapacità di rilevare variazioni di cellula--cellula all'interno delle frazioni eterogenee delle cellule può confondere la nostra comprensione dei processi biologici critici se piccoli sottoinsiemi di cellule conto per la funzione biologica dedotta di quella popolazione6, 7. Al contrario, indagine di firme di espressione del gene a cella singola risoluzione offrono una possibilità delineare eterogeneità ed eludere adombrante influenze da sovrarappresentati sottoinsiemi di cellule8.
Ad oggi sono stati sviluppati molti protocolli per analisi di espressione genica di cella singola; ogni approccio avendo propri avvertimenti. Il primo metodo era RNA fluorescente in situ ibridazione (RNA-FISH), che misura un numero limitato di trascrizioni in un momento, ma è unico in quanto permette per indagine di RNA localizzazione9,11. I primi metodi usando PCR e qPCR per rilevare che un singolo o trascrizioni molto pochi sono stati anche sviluppati12. Tuttavia, questi ultimamente sono stati sostituiti da metodi basati su microfluidica che possono analizzare simultaneamente l'espressione di centinaia di trascrizioni per ogni cella in centinaia di cellule attraverso qPCR e pertanto consentono di dimensione elevata eterogeneità analisi utilizzando pre-determinato gene pannelli10,13. Recentemente la tecnologie basate su sequenze di RNA sono stato ampiamente usate per analisi unicellulare, come teoricamente possono misurare l'intero trascrittoma di una cella e quindi aggiungere una dimensione esplorativa alla eterogeneità analisi10, 14. Multiplexed qPCR analisi e sequenziamento di RNA di singole cellule hanno caratteristiche diverse, così lo spiegazione razionale per usando uno dei metodi dipende la domanda così come il numero delle cellule nella popolazione bersaglio. Ad alta velocità e basso costo per cella nonché caratteristiche imparziali, esplorative del sequenziamento di RNA di singola cellula sono consigliabili quando cella sconosciuto o grandi popolazioni sono studiati. Tuttavia, sequenziamento di RNA di singola cellula inoltre è sbilanciata verso il sequenziamento alte abbondante trascrizioni più frequentemente mentre trascrizioni con abbondanza bassa sono inclini ai forcellini. Questo può portare a dati notevolmente complessa che mette alto-richieste su analisi bioinformatica per rivelare importanti segnali molecolari che sono spesso sottili o nascosto nel rumore tecnico15. Così, per tessuti ben caratterizzati, qPCR cella singola analisi utilizzando pre-determinato pannelli primer selezionati per geni funzionalmente importanti o marcatori molecolari possono servire come un approccio sensibile, semplice per determinare l'eterogeneità di un popolazione. Tuttavia, dovrebbe essere notato che, rispetto a cella singola RNA-seq, il costo per ogni cella è generalmente maggiore per cella singola qPCR metodi. Qui, descriviamo un approccio che unisce unicellulare RT-qPCR (modificato da Teles J. et al. 16), all'indice di FACS ordinamento contemporaneamente analisi bioinformatica e17 18 al fine di caratterizzare l'eterogeneità molecolare e immunophenotypic all'interno delle popolazioni.
In questo approccio, la popolazione delle cellule di interesse è macchiata e singolo-cellule sono filtrate di FACS direttamente nel buffer di lisi in piastre PCR a 96 pozzetti. Contemporaneamente, i livelli di espressione di un ulteriore set di marcatori di superficie cellulare vengono registrati per ogni singola cella durante FACS-ordinamento, un metodo che è indicato come indice di ordinamento. Il materiale di lisato cellulare viene successivamente amplificato e l'espressione genica di un insieme selezionato di geni analizzati con RT-qPCR, utilizzando una piattaforma microfluidica. Questa strategia consente l'analisi molecolare della caratterizzazione del ordinato unicellulare, nonché simultanea dell'espressione di marcatori di superficie cellulare di ogni singola cella. Mappando direttamente molecolarmente distinte sottopopolazioni di cellule per l'espressione dei marcatori ordinati indicizzati, le sottopopolazioni possono essere collegate a un immunophenotype specifico che può essere utilizzato per il loro isolamento futuri. Il metodo è descritto passo per passo nella Figura 1. Un pannello di pre-determinato gene ulteriormente contribuisce a una maggiore risoluzione dell'espressione genica mirata, poiché aggira misura irrilevante geni abbondanti che altrimenti possono occludere segnali di espressione del gene sottile. Inoltre, l'amplificazione dell'obiettivo specifico, la trascrizione inversa di un passo e amplificazione permette misurazione robusto di basse trascrizioni espresse, come fattori di trascrizione o RNA non-poli-adenylated. Importante, qPCR metodi consentono per la misura di mRNA da proteine di fusione, che sono importanti durante l'analisi di alcune malattie maligne19. Infine, il numero concentrato di geni studiati, bassi tassi di abbandono, e limitate differenze tecniche tra cellule rendono questo metodo facilmente analizzabile rispetto ai metodi dimensionale superiore, come cella singola RNA-seq. Seguendo il protocollo, un intero esperimento può essere eseguito, da ordinamento celle a risultati analizzati, entro tre giorni, rendendo questo un metodo semplice e veloce per analisi di espressione genica di singole cellule sensibili, ad alta velocità.
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Protocol
1. preparazione delle placche di lisi
- Usando una panchina libera di RNA/DNA, preparare abbastanza tampone di lisi per 96 pozzetti, con 10% extra, mescolando 390 µ l nucleasi acqua gratuita, 17 µ l di 10% NP-40, 2,8 dNTP mM 10 µ l, 10 µ l 0,1 M DTT e 5,3 µ l RNasi inibitore (Vedi Tabella materiali). Vortex e centrifugare.
- Distribuire 4 µ l di tampone di lisi in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 di PCR e sigillare le piastre con pellicola adesiva. Rotazione verso il basso tubi per raccogliere il liquido sul fondo delle piastre. Tenere piastre su ghiaccio fino alla cella ordinamento (massimo 24 ore).
2. preparazione delle cellule per l'ordinamento delle cellule
- Scongelare il numero adeguato di cellule (qui, arricchito staminali ematopoietiche CD34 e cellule progenitrici) per l'esperimento. 1 x 106 celle sono appropriate per l'ordinamento circa tre piastre da 96 pozzetti di singolo-cellule con controlli.
- Trasferire le cellule scongelate una provetta conica da 15 mL e aggiungere 1 mL FBS ogni 30 s fino a raggiunta un volume totale di 8 mL. Spin di cellule in una centrifuga a 350 x g per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule in 8 macchiatura buffer (PBS con 2% FBS) e centrifugare a 350 x g per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule in 200 µ l tampone e rimuovere celle di macchiatura per le macchie di controllo.
- Fanno la fluorescenza meno controlli uno (protocolli) per ogni fluoroforo, macchiando di una frazione di cellule in 50 µ l di tampone di colorazione. In questo esempio, 6 microcentrifuga con 20.000 celle è utilizzati come FMOSs. Si noti che il numero delle cellule dovrebbe essere regolato a seconda della popolazione studiata. Aggiungere tutti gli anticorpi alla stessa concentrazione come la macchia di campione ad eccezione di uno in ogni provetta.
- Rendere le macchie singole per ogni fluoroforo macchiando di una frazione di cellule in 50 µ l di tampone per ogni fluoroforo utilizzato. In questo esempio vengono utilizzati 6 microcentrifuga con 20.000 celle. Si noti che l'obiettivo per ogni anticorpo deve essere espressa dalle cellule utilizzate per i controlli. Aggiungere ogni anticorpo alla stessa concentrazione come la macchia di campione in tubi singoli. Inoltre tenere 20.000 celle non macchiate in 50 µ l come controllo non colorato.
- Per il campione di cellule, è necessario aggiungere gli anticorpi alle loro concentrazione appropriata. Usato qui sono CD34-FITC ad una concentrazione di 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 e lignaggio Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, e CD235a-PECy5 1/1000.
- Incubare le cellule con anticorpi per 30 min in ghiaccio al buio.
- Lavare le cellule con 3 mL di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 350 x g per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule e ripetere il punto 2.9.
- Risospendere il campione in 500 µ l e protocolli in 100 µ l tampone con cellule 7AAD e filtro di 1/100 di colorazione attraverso un filtro di 50 µm per ottenere una sospensione unicellulare.
3. cella ordinamento
- Assicurarsi che la macchina di FACS è impostata correttamente con ritardo di goccia e citometro installazione e monitoraggio (CST) che recentemente sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore, per garantire che le celle appropriate sono ordinate. Per cellule ematopoietiche, è consigliato l'uso della velocità 85 micron ugello e massimo di 4, mentre il tasso di eventi ottimale è compresa tra 800 e 2000 eventi/s.
- Correggere per sovrapposizione spettrale eseguendo compensazione di fluorescenza e impostare porte secondo FMO controlli o interno negativo.
- Eseguire una nuova analisi della popolazione bersaglio ordinando almeno 100 cellule bersaglio in un nuovo tubo del microcentrifuge con 100 µ l di tampone di macchia. FACS analizzare le cellule ordinate registrando il campione ordinato e assicurarsi che finiscono nel cancello di sorta.
- Set-up piatto unico cella ordinamento per la discesa nel pozzetto A1 in un piatto ben 96 di centraggio. Quando è centrata, è possibile ordinare 50 – 100 6 µm particelle in tutti i pozzetti intorno al bordo di un piatto ben 96 vuoto per assicurare che tutti i pozzetti otterrà una cella al centro di ciascun pozzetto.
- Se possibile, un controllo aggiuntivo per assicurare che le cellule vitali sono ordinate possa aggiungersi dall'ordinamento single-celle per la crescita in vitro . Cellule ematopoietiche possono essere coltivate in fondo U 96 pozzetti in 100 µ l SFEM con streptomicina 1% penicillina, 100 ng/mL FLT3L, TPO e SCF. Analizzare ogni pozzetto dopo 3 giorni nella cultura per le colonie delle cellule usando un microscopio.
- Rimuovere la pellicola adesiva da piastre. Ordinamento di una singola cella di interesse (qui Lin-CD34 + CD38-cellule) in 92 su 96 pozzetti, attivare l'ordinamento indice nel FACS ordinamento software per salvare il profilo di immunophenotypic per altri markers di interesse (qui CD45RA, CD49f e CD90) per ogni singola cella.
- Ordinare due pozzetti con cellule di 10 e 20 rispettivamente per i controlli di linearità nell'amplificazione di PCR. Wells H1 e H2 sono usati solitamente.
- Tenere due pozzi senza eventuali cellule come no-modello controlla, solitamente pozzi H3 e H4.
- Sigillare le piastre con film adesivo trasparente e girare le piastre a 300 x g per 1 min prima snap congelamento il ghiaccio secco.
- Memorizzare piatti congelati a-80 ° C.
Nota: Punto di arresto sicuro. Ordinato e lisate di cellule possono essere mantenute a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
4. inversa trascrizione e amplificazione dell'obiettivo specifico
- Preparare il mix di primer per tutti i 96 geni bersaglio aggiungendo 2 µ l di ogni coppia di primer, comprese le pulizie gene primer e primer per controllo a spillo-in RNA, in un 1,5 mL tube gratis RNasi su una panchina libera di RNA/DNA. Se si utilizza meno di 96 primer, aggiungere un volume equivalente di acqua gratuita di nucleasi per i primers mancanti. Primer devono essere ordinati separatamente per abbinare il pannello del gene desiderato.
- Rendere la trascrizione inversa e destinazione specifica amplificazione mescolare aggiungendo 632.5 µ l 2 x mix di reazione, 101,2 µ l Taq/SuperscriptIII, mix di Primer 151,8 µ l e 0,7 µ l a spillo nel controllo RNA. Questo passaggio su una panchina di DNA libero di preforme. Mescolare nel vortex e spin giù per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo. Conservare il ghiaccio fino aggiunta al campione.
- Marca no-reverse trascrizione controllo mix per quattro pozzi mescolando 27,5 µ l di miscela di reazione: 2x, 1.76 µ l di enzima Taq, 6,6 µ l di miscela primer e 2,64 µ l di acqua libera nucleasi. Spike nel controllo RNA. Eseguire questo passaggio su una panchina libera di DNA. Vortice e spin giù per raccogliere il liquido sul fondo del tubo e mantenere il ghiaccio fino a aggiunta al campione.
- Scongelare il lisato piastre sul ghiaccio. Aggiungere 8.75 µ l della trascrizione inversa precedentemente preparata e target specifico mix di amplificazione a 92 pozzi, compresi i controlli linearità e no-modello. Aggiungere 8.75 µ l del no-reverse trascrizione controllo mix quattro pozzetti rimanenti. Sigillare piastre con pellicola trasparente adesiva e spin giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.
- Preforme retrotrascrizione e amplificazione dell'obiettivo specifico eseguendo la piastra in una macchina PCR in base al programma di preamplificatore; passo 01:50 ° C per 60 min, passo 2: 95 ° C per 2 min, passo 3: 95 ° C per 15 s, passo 4: 60 ° C per 4 minuti, ripetere i passaggi 3 – 4 24 volte e infine passo 5: 8 ° C per sempre.
- Al termine della PCR, tenere la piastra a 8 ° C per la conservazione a breve termine e -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
Nota: Punto di arresto sicuro. Materiale amplificato può essere tenuto a 8 ° C per la conservazione a breve termine e a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
5. preparazione del campione e piastre di dosaggio per analisi di espressione genica di Microfluidic Multiplex
- Preparare analisi piastra di caricamento di pipettaggio 3 µ l Assay caricamento di reagente in ciascun pozzetto di una piastra ben 96. Aggiungere 3 µ l di ogni primer a singoli pozzetti nell'analisi della piastra di carico.
- Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e spin giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.
- Preparare piastra di diluizione di pipettaggio 8 µ l di nucleasi acqua gratuita in tutti i pozzetti di una piastra ben 96. Aggiungere 2 µ l di campione amplificato alla piastra di diluizione, rendendo una diluizione finale di 1:5.
- Sigillare la piastra con la pellicola adesiva, mescolare nel Vortex per 10 s e infine girare giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.
- Preparare la miscela di caricamento del campione mescolando accuratamente 352 µ l di mix master con 35,2 µ l di reagente di caricamento del campione. Preparare piatto di caricamento del campione aliquotare 3.3 µ l di mix in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 di caricamento.
- Aggiungere 2,7 µ l del campione diluito in ciascun pozzetto del campione piastra di carico.
- Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e spin giù per raccogli liquidi nella parte inferiore delle piastre.
6. caricamento del Chip microfluidico
- Stipulare un nuovo chip microfluidici 96 x 96. Preparare insenature da loro frugando con una siringa con tappo su per assicurarsi che essi possono essere spostati.
- Rimuovere le bolle da siringhe. Aggiungere volume completo di siringhe ad ogni valvola mentre inclinando il chip 45 gradi e premendo verso il basso la valvola. Primo circuito integrato con il controller IFC.
- Caricare ogni entrata di dosaggio con 4,25 µ l da ciascuno dei pozzi nell'analisi della piastra di carico. Evitare le bolle. Se le bolle appaiono nel pozzo, rimuoverli con un puntale.
- Continuare a caricare ogni entrata di campione con 4,25 µ l da ciascuno dei pozzi della piastra di carico del campione, evitare bolle e se le bolle appaiono, rimuoverli con la punta della pipetta.
- Chip di carico con il controller IFC.
- Verificare che il chip sembra anche e che sono stati caricati tutti gli alloggiamenti. Rimuovere la polvere dalla superficie del chip toccandola con nastro. Eseguire il chip della piattaforma di espressione genica microfluidici multiplex.
7. esecuzione di Chip sulla piattaforma di Multiplex Microfluidic Gene Expression
- Dopo il caricamento circuito integrato nella piattaforma di espressione di gene multisala microfluidica, il nome del campione.
- Impostare ROX come tintura passiva. Impostare singola sonda e FAM-MGB come fluorescenza. Utilizzare 96 x 96 standard v2 come protocollo. Iniziare a correre.
- Rimuovere chip quando esegue è completa.
8. preliminare analisi di Chip Run
- Caricare i dati nel software di analisi Real-Time PCR.
- Caricare i nomi di gene e cella incollando layout genica e cellulare da un file delimitato da tabulazioni.
- Immagine vista aperta e selezionare ROX come colorante. Verifica se tutti i pozzi hanno tintura passiva ROX.
- Indagare se tutte le trame di amplificazione Guarda ok, con una curva di amplificazione liscia senza picchi (simile alla Figura 3E).
- Assicurarsi che tutte le singole cellule espressione di spillo-in controllo RNA per assicurarsi che tutti siano stati caricati correttamente.
- Assicurarsi che tutte le cellule hanno espressione genica delle pulizie e così sono state ordinate correttamente.
- Garantire che 10 e 20 controlli di linearità di cella hanno circa il CT 1 differenza per convalidare amplificazione lineare.
- Verifica se c'è espressione in campioni di controllo noRT. Se l'espressione viene rilevata in noRT pensare di cambiare sonde sonde che non rilevano il DNA genomico per le esecuzioni successive.
- Esportare dati in file csv per ulteriori analisi.
9. cella singola analisi utilizzando SCExV
Nota: Un filmato introduttivo è presenti20 per introdurre lo strumento. Qui, è presentata una breve raccomandazione di come eseguire analisi utilizzando i controlli introdotti nel protocollo.
- Connettersi al sito Web SCexV20.
- Caricare il file CSV esportati.
- Ha scelto il controllo a spillo-in RNA come controllo positivo. Rimuovere qualsiasi cella che ha un controllo CT RNA superiore a 25. Normalizzare i dati all'espressione mediana del controllo RNA.
- Fare clic su "qui -> Analyze". Rimuovere noRT, notemplate, 10 e 20 controlli di cella a escludere l'opzione di cella.
- Cluster di cellule con l'approccio clustering di scelta con il numero previsto di cluster. Esportare i valori analizzati.
10. l'ordinamento indice analisi
- Aprire il software di analisi FACS e caricare i campioni indicizzati.
- Aprire l'editor di script e di eseguire lo script disponibile da Quinn J. et al. 21
- Ora che il software di analisi di FACS sarebbe opportuno un cancello, per ciascuna delle singole celle, aprire l'editor di layout e colore le cellule secondo il raggruppamento da SCexV (disponibile nel file denominato "Sample_complete_Data.xls").
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Representative Results
Il protocollo descritto è altamente affidabile e veloce, facilmente eseguite. Nella Figura 1viene presentata una panoramica della disposizione sperimentale. L'intero protocollo, dalla selezione delle singole cellule, per amplificazione di target specifici, misure di espressione genica ed analisi preliminare può essere eseguito in tre giorni. Un esempio dei risultati analizzati sotto forma di una mappa di calore che rappresenta preliminari dati analizzati dall'analisi dell'espressione genica di cella singola utilizzando 96 primer e 96 celle da un paziente di leucemia mieloide cronica (CML) o 96 celle da un invecchiato-abbinato sane controllo è presentato nella Figura 2. Utilizzo del clustering gerarchico, cellule analizzate possono essere diviso in quattro sottogruppi in base alle loro firme di espressione genica. La visualizzazione di mappa di calore è un modo conveniente per ottenere una panoramica dei dati anche per quanto riguarda controllo per pozzi che devono essere esclusi dall'analisi (ad es., pozzetti di controllo). Figura 2B è un'analisi delle componenti principali (PCA) visualizzazione simili come le cellule di ogni gruppo sono uni agli altri tramite riduzione della dimensionalità. Qui, valori erratici sono facilmente distinguibili dal resto delle cellule. Per analizzare come singoli geni sono distribuiti tra i cluster come pure differiscono tra loro, violino trame sono utili. In Figura 2, l'espressione di quattro geni rappresentativi sono indicati: il gene di fusione BCR-ABL1, che segna tutte le cellule leucemiche; il ciclo cellulare marcatore mKI67, che si esprime in un gruppo di demarcazione attivamente; l'indicatore di differenziazione mieloide MPO, che è limitato al sottogruppo in bicicletta; e infine la casa mantenendo il gene RPS18, che si esprime in tutte le cellule. Infine, in Figura 2D le firme molecolari sono state correlate a immunophenotyped, come l'identità di ogni cella in ogni cluster vengono utilizzati per colorare le singole celle in una trama di FACS generato dall'indice di ordinamento. Viene mostrato l'espressione di superficie dell'indicatore di cella per i marcatori di cellule staminali ematopoietiche CD90 e CD45RA che in questo caso potrebbe essere utilizzato per discriminare tra alcuni dei cluster e prospetticamente isolarli per l'analisi funzionale.
La microfluidica utilizzata per eseguire la qPCR cella singola è molto sensibile alla introduzione di aria o particelle nel sistema. Pertanto, è fondamentale fare un controllo di qualità post esecuzione dei dati. La figura 3 Mostra rappresentante dei dati e il contrasto tra un successo e una riuscita eseguito a causa di caricamento del campione povero. Figura 3A dimostra come i livelli di Rox dopo un successo eseguito diffusione uniformemente sopra tutti i pozzetti rassicurante che il caricamento ha avuto successo. Al contrario, Figura 3B illustra come campione e caricamento di dosaggio hanno fallito come indicato dalla mancanza di ROX in grandi parti del chip. Una volta che è stata valutata la qualità di Rox, la qualità dei segnali di espressione genica crudo può essere valutata. In Figura 3, è presentata una mappa di calore di un'esecuzione corretta, dove espressione è uniformemente sparsi in campioni con segnale forte di intorno 7-25 Ct:s. In contrasto, non figura 3D Mostra una mappa di calore di un'esecuzione non riuscita dove molti campioni hanno nessun segnale o espressione di un numero molto limitato di geni. I risultati in Figura 3D sono probabilmente a causa di un errore nell'ordinamento FACS prima dell'analisi dell'espressione genica di cella singola, dal momento che molte cellule hanno segnali di chiara espressione mentre altri sono completamente privi di espressione. Infine, Figura 3E Visualizza la curva di amplificazione previsto di spillo-in controllo RNA con tutti i pozzetti avendo chiara espressione di circa 10 CT con poca o nessuna variazione. Questo controllo positivo misura l'efficienza di tutti i passaggi nell'analisi unicellulare qPCR. Per garantire che l'amplificazione è all'interno di gamma dinamica, numeri di cellulari diversi sono inclusi come controlli di linearità; qui, 10 e 20 celle i controlli vengono utilizzati. Le differenze di CT tra controlli di linearità dovrebbero riflettere le differenze nei numeri delle cellule. Infine, la nessuna trascrizione d'inversione (noRT) e senza controlli negativi modello assicurano che nessun falsi segnali positivi sono rilevati da DNA genomico o contaminazioni, rispettivamente.
Figura 1: rappresentazione schematica del protocollo. Le cellule sono macchiate, ordinato con applicazione di indice-ordinamento attivato per registrare dell'espressione dei marker di superficie e lisate per rilasciare il mRNA. mRNA è successivamente inverso trascritto a cDNA e amplificato mediante amplificazione di destinazione specifica. Successivamente, i campioni vengono caricati insieme ai singoli iniettori in un chip microfluidici, dove il profilo di espressione genica di ciascuna cella viene analizzato usando RT-qPCR. Dopo la raccolta dei dati, i dati sono pre-elaborati per rimuovere le cellule di bassa qualità e servizio cluster viene eseguito per definire popolazioni molecolarmente distinte delle cellule. Infine, molecolare definite sottopopolazioni sono correlate all'espressione di superficie dell'indicatore da FACS Indice ordinamento dati a immunophenotypically caratterizzano l'eterogeneità delle popolazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analizza risultati rappresentativi tre successo unicellulare genica delle cellule staminali emopoietiche normali e leucemiche. (A) calore Mappa mostrante unicellulare gene misurazioni di espressione di singole 270 cellule da un paziente di leucemia mieloide cronica, così come un controllo di pari età sano analizzati mediante clustering gerarchico utilizzando SCExV 18, uno strumento di analisi progettato per questo tipo di dati. Rosso rappresenta l'alta espressione, espressione bassa blu e non grigio alcuna espressione. Le cellule sono stati divisi in quattro diversi cluster in base alle loro firme di espressione genica. È chiaro dai dati che la popolazione di cellule staminali leucemiche da questo paziente può essere diviso in una popolazione quiescente (cluster 3), con l'espressione di marcatori di differenziazione solo pochi e una popolazione attivamente divisione che ha avviato l'espressione di geni associati con differenziazione mieloide (cluster 4). I dati utilizzati qui sono da un paziente selezionato incluso nel lavoro precedentemente pubblicato da Warfvinge et al. 22 (B) principale componente analisi (PCA) dei dati visualizzati in A, dove quattro separati gruppi può essere dimostrato. (C) violino trame di quattro geni con espressione specifica di cluster, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 e MPO. Ogni trama di violino rappresenta l'espressione in ogni cluster e la linea tratteggiata attraverso rappresenta il valore medio di espressione per tutte le celle. (D) l'ordinamento indice analisi di uno dei campioni dei pazienti rappresentati nella mappa del calore, dove ogni singola cella è contrassegnata con il colore della sua sottopopolazione molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: controlli di qualità del multiplex qPCR in software Real-Time PCR. (A) Rox caricamento immagine di successo campione e caricamento di dosaggio. (B) Rox caricamento immagine del campione infruttuoso e test di carico, dove non riuscita carico di campioni è indicato da una mancanza di ROX in linee orizzontali. Caricamento non riuscito di saggi sarebbe stato mostrato in linee verticali. (C) esempio di una riuscita eseguire in calore mappa, dove single-cellule rappresentano righe e geni rappresentano colonne. Espressione genica alta è indicato in giallo, bassa espressione in blu e nessuna espressione rilevata in nero. (D) esempio di un fallito eseguire in calore mappa, dove single-cellule rappresentano righe e geni rappresentano colonne. Espressione genica alta è rappresentato da giallo, espressione bassa è rappresentata alcuna espressione rilevata come nero e blu. (E) normalizzato intensità (a sinistra) e trama di amplificazione (a destra) di un controllo di RNA a spillo-in. CT-valori di circa 10 e curve con variazione limitata indicano successo e robusto analisi qPCR, pre-amplificazione e trascrizione inversa all'interno di tutti i pozzetti. (F) normalizzato di intensità (a sinistra) e la trama di amplificazione (a destra) di un gene non riuscito. Le intensità normalizzate non formano una curva e la trama di amplificazione Mostra picchi di grandi dimensioni in fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Negli ultimi anni, analisi di espressione genica di singola cellula è diventata una preziosa aggiunta per definire l'eterogeneità delle varie popolazioni di cellule23. L'avvento delle tecnologie di sequenziamento di RNA fornisce teoricamente la possibilità di misurare l'intero trascrittoma di una cella, tuttavia questi metodi sono complicati tramite le variazioni nella profondità della cellula--cellula sequenziamento e drop-out. Cella singola qPCR offre un'analisi sensibile e robusta dell'espressione di centinaia di geni critici dove tutte le celle sono trattati allo stesso modo, riducendo il rumore tecnico. Inoltre l'analisi mirata di un numero limitato di trascrizioni consente analisi semplificata senza interferenze da parte di geni altamente espressi.
Poiché l'approccio indaga solo un sottoinsieme dei geni espressi nelle cellule è altamente importante scegliere il corretto set di geni durante la progettazione del pannello di gene. La scelta dei geni può essere fatto in diversi modi; attraverso la letteratura, i risultati precedenti di analisi di massa e l'analisi bioinformatica dei dati pubblicamente disponibili. Questo non è banale; Tuttavia, con l'insieme corretto di geni l'approccio può essere molto potente. Quando il pannello del gene è stato progettato, è importante convalidare che gli iniettori non interferiscano durante il funzionamento in multiplex. Qui si consiglia di analizzare se gli iniettori sono lineari di preformatura una serie di diluizioni con ampio materiale; una diluizione in serie di primer usati in questo studio è mostrata nella supplemental figura 2D in Warfvinge et al. 22
Le due principali limitazioni del protocollo presentato qui sono il numero limitato di cellule e geni studiati. Tuttavia, anche se solo 96 celle sono studiate in ogni esecuzione, questo protocollo relativamente semplice può essere completato in un giorno e così centinaia di cellule può essere analizzato in una settimana. Inoltre, il numero dei geni indagati potrebbe essere aumentato se gli iniettori più sono inclusi nella fase di pre-amplificazione specifica della destinazione. In questo caso, sono necessari diversi chip per indagare ogni set di 96 primers.
Se altamente espressi geni o cellule con elevato contenuto di RNA stanno venendo analizzati, il numero di cicli ottimizzata per le cellule staminali ematopoietiche con basso globale di espressione genica23 dovrebbe essere modificato. Cambiare cicli di amplificazione è anche importante durante l'analisi di massa di popolazioni. Per analisi di massa di cellule staminali ematopoietiche (100 cellule) si consiglia di ridurre la quantità di cicli di pre-amplificazione da 25 a 18.
I più comuni motivi per la non riuscita corre è a causa di esito negativo l'ordinamento delle singole cellule nel pozzetto della piastra Lisi, l'ordinamento delle cellule non vitali, suboptimale pre-amplificazione o chip errore di caricamento. Il livello di Rox in ogni camera di reazione è un indicatore del carico del campione e il dosaggio, e se questi sono bassi, si raccomanda che i campioni sono eseguire nuovamente su un nuovo chip, dal basso Rox livelli sono probabilmente causati dall'introduzione di bolle durante il caricamento. Mancanza di controllo a spillo espressione del RNA è un indicatore che il pre-amp hanno fallito, probabilmente a causa di problemi con pre-amplificazione- o invertire i reagenti trascrizione. In questo caso, è consigliabile che un nuovo chip è gestito con cellule appena ordinate e nuovi reagenti. Rilevazione di controllo RNA ma nessuna indicazione di altre espressione genica segnali è un'indicazione di infruttuoso unicellulare FACS ordinamento prima dell'analisi dell'espressione genica. Per evitare errori durante FACS ordinamento che è importante garantire che le singole cellule sono ordinate nel centro di ciascun pozzetto. Questo può essere fatto ordinare perline in un piatto vuoto e controllando visivamente dove atterra la goccia. Assicuratevi di prova-sorta in tutti i pozzetti nei bordi della piastra per garantire che il set-up non è solo corretto per i primi pochi pozzi. Quando applicabile, singolo-celle in parallelo possono essere ordinate per la crescita in vitro e analizzati prima dell'analisi qPCR al controllo per successo protocolli di ordinamento. L'ordinamento indice informazioni non solo consentono di indagare il immunophenotyped di una sottopopolazione molecolarmente distinta ma possono anche fornire spunti utili durante la risoluzione, se si esegue l'ordinamento di una popolazione non definita e molte cellule di bassa qualità sono presente nell'analisi dell'espressione genica di cella singola. Le informazioni di indice di ordinamento possono essere utilizzate per ottimizzare la strategia di gating ed evitare futuri l'ordinamento delle celle di bassa qualità.
Analisi dell'espressione genica di cella singola è rivoluzionando come eterogenee delle cellule popolazioni sono studiati e spianando la strada per ulteriore comprensione della differenziazione cellulare. Nell'ematopoiesi, analisi di espressione genica di cella singola sono stati utilizzati per affinare le strategie di ordinamento per sottoinsiemi di HSCs7, per risolvere l'eterogeneità delle popolazioni di cellule progenitrici multipotenti6,24,25 e per identificare la terapia delle cellule staminali leucemiche insensibile popolazioni22,26. Combinazione di indice ordinamento con cella singola gene espressione - e analisi funzionale precedentemente è stato indicato per essere affidabili ed efficienti durante l'analisi di immunophenotype e l'eterogeneità delle diverse popolazioni27, 28,29. Qui, un approccio per indagine molecolare e immunophenotypic eterogeneità della cellula popolazioni sono state descritte dove la combinazione di qPCR unicellulare con indice ordinamento consente risultati rapidi e riproducibili senza analisi complesse in un breve lasso di tempo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dal Swedish Cancer Society, The Swedish Research Council, la società svedese per la ricerca medica, la svedese infanzia Cancer Foundation, la Fondazione di Ragnar Söderberg e The Knut e Alice Wallenberg Foundation
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
- Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
