Summary
ここでは、TGF-β/Smad3 シグナル伝達活性アデノ ウイルス レポーター システムを使用しての生きているセルイメージ投射のためのプロトコルを提案する.このシステムはリアルタイムで転写活性を追跡し、両方単一細胞の in vitroおよび生きている動物に適用できますモデル。
Abstract
増殖因子 β (TGF-β) シグナル変換生体のホメオスタシスに必要な多くの重要な機能を調節して、一般的に発見がんなど多くの疾患で過剰に発現します。TGF β が強く関与している転移の遅段階の癌の進行中に渡り鳥や侵襲性の腫瘍細胞のサブセットをアクティブにします。シグナル伝達経路解析のための現在の方法はしばしば生物学的イベントのシグナリング事後を測定しようとし、病気の進歩的な性質を反映していないエンドポイント モデルに焦点を当てます。ここでは、TGF-β/Smad3 シグナリングパス生細胞における転写活性化を検出するための新規アデノ ウイルス レポーター システム固有を示します。広告 CAGA12-Td トム記者を活用し、24 時間体外内の MDA MB 231 セルの 100% 感染率を実現できます。蛍光レポーターの使用により、活単一細胞のイメージングの転写活性状態の細胞の直接同定とリアルタイム。TGF-β と感染細胞の刺激が転写活性アクティブで、特定の生物学的機能に関与する細胞のサブセットのみが表示されます。このアプローチは高い特異性と単一細胞レベルでの感度の TGF-β シグナリング体外に関連する生物学的機能の理解を高めることできます。Smad3 転写活性することができます報告体内でリアルタイムのアプリケーションを介して、広告 CAGA12- リュック ・記者。広告 CAGA12- リュック伝統的な固定して transfected ルシフェラーゼの細胞と同じ方法で測定することができます。Smad3体内移植細胞の転写活性は従来の IVIS イメージングによる解析でき、TGF-β シグナル伝達経路のダイナミクスにユニークな洞察力を提供すること、腫瘍の進行中にライブ モニターします。我々 のプロトコルを記述する生きている細胞のシグナル伝達経路のクイック高速イメージングを可能にする有利な記者配信システムの in vitroとin vivoの両方。このメソッドは、イメージ ベースのアッセイや基礎生物学と治療開発のため高感度で再現性のあるアプローチとして提示の範囲に拡張できます。
Introduction
トランスフォーミング増殖因子 β (TGF-β) は、信号をヘテロ二量体複合体 II 型を介して人間の開発に関与している重要なサイトカイン受容体1型します。募集およびタイプのリン酸化のタイプ II の受容体に結合結果 I 受容体は、順番に下流 Smad2/3 タンパク質2,3を廃止します。これらは核に移行し、4遺伝子の転写を調節する複合体を形作る Smad4 へ Smad2/3 蛋白質のバインドを活性化。TGF-β/Smad の恒常条件下で信号が堅く調整される;ただし、多くの病気のシグナル伝達経路は自由化は、しばしば病5,6、7の進行につながる過剰に発現します。最近の研究は、TGF β 細胞応答が異種 TGF-β/Smad アクティブな細胞の集団は、時間依存的8,9の生物学的機能を実証しています。TGF-β/Smad シグナリングの一般的な細胞解析は、細胞の活動のスナップショットのみを提供し、しばしば平均 TGF-β/Smad 効果10量的に表わす固定エンドポイント アッセイの使用を含みます。これらのメソッドは、ただし、可能性があります正確に表していない TGF-β/Smad は病気の進行時生理状態の伝達の分子の挙動。生きているセルのイメージ ベース解析は、時空の理解の両方の細胞および生物学的プロセスのダイナミクスをキャプチャします。
私たちの目標は、TGF-β/Smad アデノ ウイルス ベースの試薬を用いるシグナリングの生きているセルイメージ投射のための高感度ハイスループット法を開発することでした。ここでは、我々 感染ひと乳癌癌セルライン MDA MB 231 Smad3 CAGA モチーフ バインド シーケンスとルシフェラーゼ (リュック) または Td トマト (Td トム) レポーターの遺伝子を表現するアデノ ウイルス。アデノ ウイルス レポーター システムは、癌細胞株における 100% 感染率につながるプラスミド導入クイックで安価な方法を提供します。アデノ ウイルス レポーター系も正常に従来のプラスミド11transfect に困難細胞に適用されています。このプロトコルでは TGFβ/Smad のシグナル伝達経路の生きているセルイメージ投射を達成するために、再現性と非侵襲的プロセスを述べる体内と体外の両方。
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Protocol
すべての動物実験は、メルボルンの動物倫理委員会の大学によって承認されました。
注: シーケンス、建設、世代プロトコル、アデノ ウイルスのベクトル p広告 CMV Td トム、p広告 CMV GFPと p広告 CAGA12- リュック ・/Td-トム前述11,12となっています。 13。すべてのベクトルが市販されています。
1. ウイルス力価測定 50% 組織培養感染量 (TCID50) を使用して
- 1 x 106 DMEM + 10 %fbs メディアの 10 mL の HEK293A セルを準備します。
- 96 ウェル平底細胞培養プレートの各ウェルに、細胞懸濁液を 100 μ l 添加をシードします。
- 1 mL の完全培地のウイルス ストックの 1: 100 希釈を準備します。1 列目のウェルに希薄ウイルスの 11 μ L を追加します。
- 96 ウェル プレートに直接細胞懸濁液を 100 μ l 添加で 1 の最終希釈まで希薄ウイルスの 11 μ L を混合することによって連続 10 倍希釈液を実行12に達する x10。非付着性細胞がこの段階で井戸間で転送される細胞の数は変わりません。
- 各希釈 10 の最高の希釈から始まる各列に 11 μ L をピペット4。ウイルス粒子のクロス オーバーを制限する各希釈ピペット チップに置き換えます。
- ネガティブ コントロールとして列 12 に 11 μ L のウイルス無料完全なメディアを追加します。
- プレート 10% CO2と 37 ° C で 7-10 日間インキュベートします。
- 顕微鏡を使用して、細胞変性または細胞毒性効果の兆候を表示する各列の井戸の数を獲得します。感染症の兆候がある場合は、よく正を検討してください。
- リードと Muench14(1938) 統計的手法を使用してそれぞれの希釈のための肯定的な井戸の割合を計算します。
- 比例距離 (PD) を使用して計算: (A-50)/(A-B)、A は回答率 50% 以上、B は 50% 以下回答率。
- TCID50を使用して計算: 10X PDX は希釈 50% より大きい応答を与えること。
- 次を使用してからウイルス力価を計算: 0.69/(0.011 x TCID50) PFU/mL
2. アデノ ウイルス慣性モーメント測定
- 種子 1.0 1.5 を 500 μ l の 10 の5 MDA MB 231 セル x DMEM 培地 FB、12 の各ウェルのウェル プレート 5% 含む (35% の confluency、合計で 6 井戸) の。
- 0、250、500、2500 に必要なAd CMV Td トム株式市場で次の数式を使用して 5000 の MOI のボリュームを計算: MOI = (ボリューム [μ] PFU/μ L x)/セル数。1 x 1010 (PFU/mL)、ウイルス感染のボリュームの価と広告 CMV Td トムは、必要なモア、0、3.75、7.5、37.5、75 μ L がそれぞれ。
- 徹底した混合井戸にウイルス株を直接ピペッティングによる広告 CMV Td トムセクション 2.2 での計算されたボリュームで細胞に感染します。
- 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
- 井戸からメディアを削除し、すぐに 5 分間 10% ホルマリンの 500 μ L のセルを修復します。
- 井戸からホルマリンを吸引し、500 μ L の PBS で 1 回洗浄します。
- ヘキスト溶液 5 分間の 500 μ L の細胞核を染色します。
- ヘキスト ソリューションを削除し、500 μ L の PBS 3 回と井戸を洗浄します。
- 蛍光顕微鏡で 200 倍の倍率を使用して Td トマト タンパク質と細胞核の信号のイメージ。554 で Td トマト蛋白質をエキサイト nm と 352 のヘキスト染料 nm。
- MOI は Td トマト15100% 感染に必要な作業を決定する ImageJ を用いた画像を分析します。
3 ライブの単一細胞におけるデュアル アデノ ウイルス伝達
- 種子 1.0 1.5 を 500 μ l の 10 の5 MDA MB 231 セル x DMEM 培地 FB、12 の各ウェルのウェル プレート 5% 含む (35% の confluency、合計 2 井戸) の。
- 75 μ広告 CMV GFPの細胞に感染する (力価 = 5 x 109 PFU/mL) とAd CAGA12-Td-トムの 7.5 μ L (価 = 5 x 1010 PFU/mL) 2,500 の慣性モーメントは、100% 感染陽性を達成することができますを取得します。
- アデノ ウイルス感染後すぐにセル (10 mg/mL 入荷、最終濃度として 5 ng/μ L) ウェルあたり TGF-β の 0.25 μ L の有無を扱います。
- 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
- 画像位相コントラスト蛍光顕微鏡による生きた細胞。470 nm、554 で Td トマト蛋白質に GFP をエキサイト nm。
- セルを修正し、1.9 1.6 の手順で説明するように細胞核を染色します。
- イメージ Td トマト タンパク質とヘキスト染色蛍光顕微鏡を用いたします。352 でヘキスト染料をエキサイト nm。
- ImageJ を用いた GFP および Td トマト陽性率細胞15を計算します。
4. 単一細胞シグナリングに創傷治癒の試金
- 種 4-5 105 MDA MB 231 セル 1 mL x DMEM 培地 FB 6 の各ウェルのウェル プレート 5% 含む (50% の confluency、合計 2 井戸) の。
- 広告 CAGA12-Td-トムの 22.5 μ L で細胞に感染する (力価 = 5 x 1010 PFU/mL、MOI = 2,500)。
- 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
- P200 ピペット チップを使用して各ウェルの細胞の層の 2 つの交差線をスクラッチします。
- 井戸から古いメディアを削除し、新鮮な 5 %2 mL で FBS メディア (10 mg/mL 入荷、最終濃度として 5 ng/μ L) ウェルあたり TGF-β の 0.5 μ L の有無を置き換えます。
- 10% の CO2と 37 ° C で 5 分間のインキュベーターでプレートを置き、位相差顕微鏡で 100 倍の倍率を使用して選択した創傷部の画像を取る。
- 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
- 同じ分野で傷の閉鎖の画像を取る。
- セルを修復する、1.9 1.6 の手順で説明するように細胞核を染色および創傷部・蛍光顕微鏡で 200 倍の倍率を使用して非創傷部に Td トマト信号を視覚化します。
- 傷や ImageJ ソフトウェア15を使用して非創傷部で Td トマト陽性細胞の割合を定量化します。
5. ルシフェラーゼ アッセイ体外
- 3-5 mL の 5% を含む DMEM 培地 1 で 10 の4 MDA MB 231 セルの細胞懸濁液を準備政府短期証券。
- 感染細胞懸濁液を 2.5 μ広告 CAGA12- リュック ・ (力価 = 5 x 1010 PFU/mL、MOI = 2,500)。
- 種子、96 に感染した細胞は、3,000 セル/100 μ L/ウェルでウェル プレートします。
- 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
- 井戸から古いメディアを削除し、新鮮な 5 %fbs メディア (1 Mg/ml とストック、最終濃度として 1 ng/μ L) ウェルあたり TGF-β の 0.1 μ L の有無の 100 μ L に置き換えると 0.17 μ L/ウェル (7 mg/mL 入荷 TGF-β 阻害剤の有無、最終濃度として 12 ng/μ L) (新規 TGF-β リガンド トラップ蛋白質、陳ら、未発表の作品)。
- 10% の CO2と 37 ° C で 24 時間のインキュベーターでプレートを配置します。
- ルシフェラーゼ アッセイ システム基板を解凍し、文化 1 x 細胞二重蒸留水 (DDW) 溶解液を準備します。
- 96 ウェルからメディアを取り出し、30 分穏やかな攪拌と軌道のシェーカーを使って氷の上 1 x 細胞文化換散バッファーの 50 μ L と井戸を溶解させます。
- ライセートの 30 μ L を各ウェルから不透明なルシフェラーゼ プレートに転送でき、部屋の温度を暖かくプレート。
- ルミノのソフトウェアでは、新しいプロトコルを作成します。1 注射前に、と注射後の測定を選択します。投与前に、の測定値を 1 に設定測定における遅延と積分時間の両方のための s。噴射量測定後の注入量に設定 1 の遅延測定で40 μ L 注入前後 5 s s積分時間。設定を確認するには、 [ok]を選択します。
- DDW にインジェクター チューブを置き、首相の設定で使用する前にインジェクター チューブをきれいにするインジェクター 1ボタンをクリックします。次 DDW とチューブからすべてのソリューションをフラッシュするインジェクター 1 の 2 つのさらなる素数が続く空気の場所からインジェクター チューブを削除します。ホタル基板と再び 2 回基板を準備する総理にインジェクター チューブを配置します。
- ルミノにサンプルで不透明なルシフェラーゼ プレートを置き、ソフトウェアのオプションを選択します。関心の井戸を強調表示し、[適用] をクリックします。ルシフェラーゼ信号の計測を開始を押してください。
- 測定が完了したら、削除し、水でプレートをすすいでください。インジェクター チューブに空気に総理インジェクター 1 ホタル基板チューブにチューブを配置することによって任意の残りの基板を回復します。DDW にインジェクター チューブを置き、任意の残りの基板のインジェクター チューブをきれいにする 2 つのさらに素数を実行します。
6 ライブ シグナル伝達イメージングは生体内でセル準備
- 腫瘍移植前に h 48 175 cm2フラスコ (合計 10 フラスコ) に 2-3 x 10 の6 MDA MB 231 細胞をシードします。20 mL の 5% を含む DMEM 培で細胞の培養 37 ° c、10% CO2FBS。
- 24 h 後で、追加の 300 μ L広告 CAGA12- リュック ・ (力価 = 5 x 1010 PFU/mL、MOI = 2,500) 各フラスコに。さらに 24 時間培養細胞を保ちます。
- 注入の日、古いメディアを削除し、20 mL の PBS、pH 7.4 で一度アデノ ウイルスが感染した細胞を洗浄します。フラスコに 0.05% トリプシン-EDTA の 2 mL を加えてトリプシン フラスコのすべての面をカバーするように少しフラスコを振る。37 ° C で 3 分間 10% CO2インキュベーターでフラスコを配置します。
- フラスコに 8 mL の FBS を含む DMEM 培地を加えることによって、トリプシンを癒します。すべての細胞懸濁液を試薬瓶に転送します。
- 診断を使用してセル数をカウントし、2 つの 50 ml の遠心管に 10 の7セル x 4.8 を転送します。
- トリプシンを削除し、新規メディアの FBS DMEM の 720 mL の細胞を再懸濁します RT で 5 分間 400 x g で細胞を遠心します。
- 5 mL の滅菌チューブに細胞懸濁液を転送し、160 μ L を追加マトリゲル (10% 合計マトリゲル懸濁液)。
- 着床まで氷の上の細胞を保ちます。
7. 同所性同種移植
- 12 SCID マウスの重さし、制御そして処置のグループ (6 マウス/グループ) にマウスをランダムに割り当てます。
- 無菌環境を維持するために滅菌バイオ キャビネットの注入を実行します。1 L/分場所熱パッドの上でマウスの酸素流量を 2.5 〜 4.5% イソフルランを使用してマウスを anaesthetize や角膜の損傷を避けるために両方の目に眼軟膏を潤滑油のドロップを施します。鼻の円錐形に鼻を配置することによって麻酔を維持、イソフルランに接続している間、仰臥位で熱パッドにマウスを修正します。
- ピンチをつま先に反応の欠如によって麻酔の成功を確認します。イソフルランを 1 L/分の酸素注入のメモのために 1.5-2.5% の維持投与量に減らします。
- 80% エタノールに浸した綿棒を使用して、正中線を両側第 4 ニップルから皮膚をきれい。
- 触診を通じて 4回乳腺脂肪パッドを見つけるし、さらに組織を公開するための脂肪パッドを絞る。
- 細胞懸濁液を上下にピペッティングでよく混ぜます。優しく 27 G インスリン注射器に細胞の混合物の 50 μ L を吸引し、マウスの両側乳腺脂肪パッドに注入します。
- 脂肪パッドの腫れの感じで成功した注入を確認します。優しく脂肪パッドを解放し、マウスをケージに配置します。
- 意識を得るし、3 日間開催の部屋に戻ってケージを配置するマウスを許可するように、少なくとも 30 分間熱パッドにケージを残します。
8. IVIS イメージング
- 生活イメージソフトウェアを開きます。
- コントロール パネルの [ IVIS システムの初期化ボタンをクリックして IVIS システムを初期化します。温度記号が緑色に点灯するまで待ちます。
- コントロール パネルの発光イメージング モードを選択します。
- 商工会議所と IVIS システムにイソフルラン麻酔を入れます。
- 1 L/分の酸素と 2.5 〜 4.5% イソフルランを使用してマウスを anaesthetize します。イソフルランを麻酔、メンテナンスのため 1.5 2.5% で設定します。D-ルシフェリンの 150 mg/kg 体重をマウス腹腔注射による注入します。
- IVIS システムにマウスをすぐに転送、温度制御のイメージング プラットフォームに配置し、鼻の円錐形に鼻を配置します。
- コントロール パネルの [順序の設定] ボタンをクリックし、培地ビンを選択します。
- 画像の露光時間を次のように設定: 10 s、20 s、30 s, 60 s、120 s の開始ルシフェリン注射後約 3 分の画像と信号がドロップを開始するまでをイメージ引き続き (通常これは約 20 分を要するでしょう)。
- 鼻の円錐形をイソフルラン麻酔を維持しながら IVIS からマウスを削除し、50 μ L の PBS と 50 μ L TGF-β シグナル伝達阻害剤 (50 μ g/腫瘍) 内腫瘍注射を介してマウスを治療します。
- ケージに戻ってマウスを入れて、少なくとも 30 分間熱パッドにそれらを残します。その後、持株の部屋に戻ってケージを配置します。
- 治療の翌日に上記のように手順をイメージング IVIS を繰り返します。
9. データの分析
- オープンリビング イメージソフトウェアにファイルを保存します。
- ビューを使用した画像情報を見つける |イメージの情報。
- 同じ露光時間と同様の時間ポイントで撮影した写真を選択します。グループとして写真をロードします。
- 強度を正規化するイメージ調整を個々のボックスをオフにします。
- 強度を分析するフォトンモードを選択します。ROI ツールの関心領域 (ROI)ボタンを選択することによって、信号の強さを定量化します。
- 発光信号を含む領域を ROI 円をドラッグし、信号強度を取得するメジャーをクリックします。
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Representative Results
単一細胞の in vitroイメージングをライブします。
TGF-β/Smad 基づくアデノ ウイルス試薬を用いた単一細胞におけるシグナル伝達の活性化を正確に評価するには、まず、最適な多重度の感染症 (MOI) の各セルの行を調べることが重要です。最適な MOI は、細胞の 100% がない存在の細胞変性または細胞毒性効果を持つアデノ ウイルス感染症の肯定的なときに決定されます。これを判断するには、肯定的な感染のマーカーとして機能する恒常活性広告 CMV Td トム記者を使用しました。アデノ ウイルス感染細胞の割合は、5,000 の MOI に 0 から MOI 依存的に増加しました。2,500 の MOI で MDA MB 231 細胞 (図 1 a、1 b) 100 %td トム式を見ました。ピクセル強度/セルは、強化された感度と転写出力 (図 1) の検出を提供する、MOI とも増加しました。したがって、作業 2,500 の慣性モーメントは、細胞が広告 CMV GFP (細胞への感染のための肯定的な制御を務めた) とAd CAGA12-Td トムに同時に感染した感染症は、デュアルを実行する使用されました。単一のセルは、ライブと固定の両方のセルのセルの間で異種 TGF-β/Smad3 転写活性化を示す Td トム表現のさまざまなレベルを提示しました。(図 2 a、2 b)。MDA MB 231 細胞が GFP 発現程度細胞の 26% は、TGF-β 治療 (図 2) なし 0% 陽性と比較して、TGF-β 刺激後検出 TGF-β/Smad3 転写活性 24 h を表示しながら表示の 100%。基づくアデノ ウイルス試薬を使用して、生物学的プロセスの間に TGF-β/Smad3 の転写活性を調査するには、MDA MB 231 細胞 2500 MOI で広告 CAGA12-Td トムに感染している, 創傷治癒の試金を受ける.感染した MDA MB 231 セルは、通常の移行挙動と 5 ng/ml の TGF-β 非 TGF-β 扱われた細胞 (図 3 a) と比較して強化された傷の閉鎖を示した細胞を表わした。特に、約 62% 創傷部の細胞は、TGF-β 治療 (図3 b) 後の傷以外の地域 (32%) で観測されるよりも高くである正の TGF-β/Smad3 転写活性を提示しました。などを用いたアデノ ウイルス試薬検証ライブ単一細胞の in vitroにおける TGF-β のシグナル伝達経路のイメージングのためのアプリケーションです。
TGF-β イメージング生体内シグナル伝達をライブします。
広告 CAGA12- リュック ・レポーターの感度最初テストあった体外TGF-β 刺激と TGF-β 阻害剤の存在に対応。感染した MDA MB 231 セルが 1 ng/ml の TGF-β 刺激された、ルシフェラーゼ レポーターの活動が 1,200-fold 基底未処理 MDA MB 231 レベルと比較して増加しました。この応答は、TGF-β 阻害剤 (図 4 a) の 12 μ G/ml に著しくブロックされました。広告 CAGA12- リュック試薬はその後乳房腫瘍同所性同種移植の動物モデルでテストされました。コントロールと TGF-β 阻害剤の両方グループ示された同じようなルシフェラーゼ レポーターの活動治療前に扱われます。ただし、コントロール グループのルシフェラーゼ信号変わりませんでした PBS 治療後に対し、約 3 倍の信号減少 (図 4 b4 C) を示した TGF-β 阻害剤と扱われるマウス。総称して、これらの結果は TGF-β シグナル伝達活動生体内で動物の犠牲を必要とせずのライブおよびリアルタイム監視の可能性を示しています。
図 1。アデノ ウイルスを用いた試薬の MOI の定量します。MDA MB 231 細胞は異なる MOI で広告 CMV Td トムに感染, 12 ウェル プレートに播種します。感染後 24 時間は、細胞が修正され、ヘキスト核染色します。(A) 画像の Td トム陽性細胞 (赤) と (青) の核を視覚化する撮影されたし、ImageJ で量を示されます。(B) 割合の Td-トム陽性細胞。(C) Td トム ピクセル強度/セルは背景に正規化します。これらの数字は、少なくとも 3 の独立実験の代表です。表示されるデータは、トリプリケート ± SD. スケールの手段バー = 50 μ m (200 X)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。二重感染の単一細胞イメージングします。MDA MB 231 細胞であった広告 CMV GFPと MOI (2,500) でAd CAGA12-Td トムに感染し、12 ウェル プレートに播種デュアル.24 h 5 ng/mL TGF-β の有無感染後セルが扱われました。(A) 24 h 治療後、細胞がライブ GFP 陽性 (緑) と Td トム肯定的な (赤い) 細胞を可視化するイメージを作成します。固定された細胞と定量化のため核ヘキスト染色します。(B) 画像は、GFP 陽性 (緑)、Td トム肯定的な (赤い) 細胞と核 (青) を視覚化する撮影されました。か Td トムの (C) の GFP 陽性細胞は ImageJ で定量化されたし、陽性細胞の割合を算出しました。これらの数字は、少なくとも 3 の独立実験の代表です。表示されるデータは、トリプリケート ± SD. 統計的意義は、スチューデントの t 検定によって定められた手段 (* * * p ≤0.0001)。スケールバー = 50 μ m (200 X)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。細胞遊走を促進する生きているセル TGF-β シグナリングします。MDA MB 231 細胞 MOI (2,500) でAd CAGA12-Td トムに感染, 6 ウェル プレート上にシード.感染後 24 時間は、細胞が傷が P200 ピペット チップを使用して傷を作成してメディアが置き換えまたは 5 ng/mL TGF-β なし。別の 24 時間後のセルが修正され、ビジュアル表現の核ヘキスト染色します。(A) 創傷閉鎖、スケールのコントラストを相バー = 100 μ m (100 X)。(B) Td トム肯定的な (赤い) 細胞と核 (青)。スケールバー = 50 μ m (200 X) (C) Td トム陽性細胞は ImageJ で定量化されたし、陽性細胞の割合を算出しました。これらの数字は、少なくとも 3 の独立実験の代表です。表示されるデータは、トリプリケート ± SD. 統計的意義は、スチューデントの t 検定によって定められた手段 (* * * p ≤0.0001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。TGF-β シグナル伝達のイメージングが住むvivo 。(A) MDA MB 231 細胞に感染した広告 CAGA12- リュック ・と 24 h の 96 ウェル プレートに播種しました。その後、セル扱われた 1 ng/mL TGF-β の存在か不在で 12 μ g/mL TGF-β 阻害剤の有無で一晩。ルシフェラーゼ活性は、全細胞ライセートに基づいて測定しました。ルシフェラーゼの活動は、誘導治療コントロールなしに正規化の倍として提示されました。表示されるデータは ± SD. (B) MDA-MB-231 細胞をトリプリケートの手段広告 CAGA12- リュック ・注入前に 24 h。セルは、SCID マウスの両側乳腺脂肪パッドに移植されました。(コントロール グループの PBS) と 50 μ g/腫瘍 TGF-β 阻害剤治療群の 24 時間治療前後 72 h 後、イメージング IVIS 行った(C) 光子フラックスの生活イメージ ソフトウェアによって定量化を行った。表示されるデータは各治療群の手段 (n = 12) ± SD. 統計的意義は、スチューデントの t 検定によって決定された (* * p ≤0.01 * * * p ≤0.0001)。p/s は、光子/s.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
TGF-β/Smad3 は単一生細胞におけるシグナル伝達のリアルタイム イメージングを可能にする技術を開発しました。この手法を使用すると、動的の TGF-β/Smad3 転写活性強化された侵入および移行8に関連付けられていたと以前セルのサブ人口を同定しました。このメソッドが TGF-β シグナル、Smad3 リン酸化の西部のしみなどの伝統的なアッセイに向上し、TGF-β は、不均一性をキャプチャすることにより遺伝子発現を対象と TGF-β/Smad3 腫瘍集団内におけるシグナル伝達と強調表示の単一のセルの生物学の重要性。さらに、単一細胞イメージングでは、核移行は、時間がかかり、高価な別の方法で実行される場合細胞し、遺伝子転写16,17に常に翻訳しないかもしれない。これらのメソッドは、上流シグナル伝達経路を調べることが重要ですが、アデノ ウイルス レポーター システムは生物学的機能に関連して個々 の細胞における TGF-β/Smad3 シグナリング ユニークな視点を提供します。
本手法が体内の TGF-β/Smad3 シグナル伝達経路の検出の高感度で再現性のあるメソッドを提供します大幅に腫瘍の進行と治療中にリアルタイム。伝統的な安定したルシフェラーゼ生体内イメージングと同様に、TGF-β/Smad3 マウス内で信号の検出は、細胞数とプロモーター活動18のレベルに依存です。皮下組織は、分析のための少し干渉を提供しながら、細胞の増加の深さは信号検出の感度を減らします。他の臓器は、肺や骨、他の癌などで使用するためのメソッドを展開することが可能です。ただし、信号の最適化やex vivoイメージングには、関心の癌モデルに必要な感度を達成するためにことをお勧め。
アデノ ウイルス レポーター システムを使用しての追加の利点は、そのアプリケーションは生きているセルで同時に複数のシグナル伝達経路の解析に拡大する可能性が高いです。図 2 a、2 の独立したアデノウイルスベクター、CMV GFP と CAGA トム増殖型 MDA MB 231 セル可能性があります私たちを示した。蛍光レポーター蛋白質とルシフェラーゼ レポーター (ホタルと Guassia ルシフェラーゼ レポーター蛋白質を使用) の両方を介して 2 つの異なるシグナル伝達経路を報告するこのデュアル感染システムをさらに拡張できます。私たちの研究室は、同時ライブがん細胞株 (データは示されていない) の数の BMP/Smad1 と TGF-β/Smad3 のシグナル伝達経路のシグナル伝達を実現しています。
アデノ ウイルス レポーター系両方の in vitro TGF-β/Smad のシグナル伝達経路の生きているセルイメージ投射のための簡単で便利な方法を提供してin vivo。このシステムは、他の一般的に使用されるレポーター システムの利点を持ちます。まず、アデノウイルスベクターはそれらの19,20,21,22を変換しにくい細胞の最適システムを作る最高のウイルスの伝達効果の間であると報告されました。さらに増加の外因性 DNA の容量23を可能にするウイルスのゲノムの大部分を削除することによって、ウイルスの技術の現在の進歩、'根性' アデノウイルスベクターを生成できます。アデノウイルスベクターがはるかに大きい配信効率19,20,21 の結果細胞伝達のコスト効果の高い、迅速かつ簡単なアプリケーションを表す非ウイルスの伝達システムと比較して ,22。
このプロトコルを使用して、レプリケーション無能である第二世代のアデノ ウイルス発現系 E1a および E1b のタンパク質を発現していない哺乳類セルのバイオセイフティ リスク24を最小限に抑えます。しかし、にもかかわらず、これらの強化されたバイオ セーフティ機能、アデノ ウイルス粒子はまだすることができます変換高効率25,26ひと初代細胞です。ときに汚染された機器のアデノ ウイルスを取り扱ったり処分米国バイオ セーフティ レベル 2 とアデノ ウイルスのベクトルの封じ込めを推奨します。HEK293A 細胞におけるアデノ ウイルスの大規模な拡大は、アデノ ウイルス「野生型」レプリケーション有能な27のまれな生成で起因できます。PCR のスクリーニングは、野生型汚染27を識別するために行わなければなりません。
複製無能なアデノウイルスベクター式で一時的なものとホスト DNA20,21に統合されません。長期実験の妥当性を確認するアデノ ウイルス レポーター システムを使用する場合、実験者がそのレポーター蛋白質の表現の安定性を識別することをお勧めします。セル内アデノ ウイルス ベクターの発現時間はセルとウイルス MOI の部時間に比例します。再現性のある結果を得るには、ウイルスの力価がウイルス バッチごとに正確に決定されることが重要です。また、アデノ ウィルスの過度に高いボリュームは、細胞毒性や細胞変性効果につながる、それは重要な最高の結果を確保するため使用される最適なモイが並ぶ各セルの経験的決定されること。さらに、アデノウイルスベクターの生体内で使用は、免疫応答を引き起こすことができます。免疫応答は、実験の主な観測ではない免疫不全動物が20,21をお勧めします。ターゲットの免疫応答にアデノ ウイルスのベクトルを使用するときは追加の品質管理が必要、アデノ ウイルスの使用は、ワクチン療法28,29にアジュバントとして検証されているにもかかわらず。
アデノ ウイルス レポーター システムは、分割と非分裂の両方のプライマリおよび培養細胞の広い範囲で使える自然20,22。アデノ ウイルス レポーター システムを使用して、脳を含むがん細胞の数で 100% 感染率を達成している、乳がん、よく主な発生学的マウス線維芽細胞 (MEF)、イヌの腎臓上皮 (MDCK) 細胞として大腸。さらに、アデノ ウイルスのベクトルを伝達30,31の改良された器官をターゲットと有効性を提供する、特定の細胞型受容体に対する親和性を高めるためさらに変更できます。
このメソッドのアプリケーションは、他のシグナル伝達系と細胞ホストに拡張できます。アデノ ウイルス レポーター システムの主な利点は、安い、高伝達効率、簡単な実験装置とホスト DNA21,32との統合の欠如を含めます。このメソッドは、多くの現在の試金および新しい標的治療33の評価を含む、モデルの体内に適用できます。我々 は、この技術の使用がシグナル伝達経路と新たな生物学的発見や新しい治療法の開発につながる生物学的プロセスの間の関係の私達の理解を高めることを願っています。
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Disclosures
利害の衝突を報告しません。
Acknowledgments
この作品は H JZ に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの助成金によって支えられました。TMBW は、Templestowe ロータリーと治療のための食事のパートナーにオーストラリア政府からオーストラリア大学院賞、オーストラリアのロータリー健康からアン ヘンダーソン トップアップ奨学金の受信者であります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
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