Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist
Summary
Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.
Abstract
Ontluikende gist is wijd verbeid gebruikt als een model in het bestuderen van eiwitten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens. Genoom-brede genetische screening is een krachtig hulpmiddel gebruikte gist studies. De expressie van een aantal neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten in gist zorgt ervoor dat de cytotoxiciteit en statistische vorming, Recapitulerend bevindingen gezien bij patiënten met deze aandoeningen. Hier beschrijven we een methode voor het screenen van een model van de gist van de Amyotrofische laterale sclerose-geassocieerde proteïne FUS voor parameters van de toxiciteit. In plaats van transformatie, berust dit nieuwe platform voor screening op de paring van de gist te introduceren een gekleed bibliotheek van plasmiden in het model van de gist. De paring methode kent twee duidelijke voordelen: ten eerste, het is uiterst efficiënt; Ten tweede, de vooraf getransformeerde gekleed bibliotheek van plasmiden kan worden opgeslagen voor de lange termijn als een voorraad van glycerol en snel toegepast op andere schermen zonder de arbeidsintensieve stap van transformatie naar het model van de gist telkens. We laten zien hoe deze methode kan met succes worden gebruikt aan het scherm voor de genen die de toxiciteit van FUS wijzigen.
Introduction
De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae heeft wijd gebruikt in fundamenteel wetenschappelijk onderzoek1 om te begrijpen van de cellulaire processen rechtstreeks verband houdt met ziekten bij de mens. Bovendien, het is gebruikt als een modelorganisme bestuderen van menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten, zoals die in verband met de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en Amyotrofische Laterale sclerose (ALS)2. Een voordeel van de gist-model is het gemak waarmee een genoom-brede scherm kan worden uitgevoerd om te identificeren van cellulaire routes in verband met de toxiciteit van ziekte-gerelateerde eiwitten, waardoor inzicht in het mechanisme van hun toxiciteit. Één dergelijke scherm heet een overexpressie bibliotheek scherm, waarin elk van de 5.500 gist genen in een gekleed bibliotheek is omgevormd tot een model van de gist om te identificeren welke genen toxiciteit wanneer overexpressie kunnen wijzigen. Deze screeningmethode is succesvol toegepast in de modellen van de gist van meerdere neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten, met inbegrip van huntingtin voor de ziekte van Huntington3, α-synuclein voor de ziekte van Parkinson4,5 , Aβ voor Alzheimer’s disease6, FUS en TDP-43 voor ALS7,8,9. Terwijl het gebeurt meestal in een high-throughput wijze10, is de meest arbeidsintensieve stap van het scherm afzonderlijk 5.500 gist genen uit een gekleed bibliotheek transformeren. Deze stap moet worden uitgevoerd telkens wanneer die de screening wordt herhaald, en wanneer een nieuw opgerichte gist-model moet worden bestudeerd. Het is belangrijk om te vinden van een meer efficiënte manier om deze taak te volbrengen.
Gistcellen kunnen stabiel in zowel haploïde en diploïde vormen bestaan. Er zijn twee tegenover paring soorten haploïde cellen, paring type een en α. haploïde cellen van elke paring Typ produceren en afscheiden van hun eigen specifieke paring feromoon, waarop alleen de tegenovergestelde paring type cellen reageren. Hierdoor wordt de paring tussen een en α cellen tot stabiele diploïde cellen, een/α. Dit proces is spontaan en hoogefficiënte11. We kunnen profiteren van deze unieke levenscyclus van S. cerevisiae in te voeren van de plasmide-bibliotheek. Meer in het bijzonder, zal elk gen in de gekleed plasmide-bibliotheek worden omgezet in haploïde cellen van één paring type, dat wil zeggen, α-cel. Deze cellen met de genen van de bibliotheek zal dan in glycerol voorraad in een gekleed 96-Wells-indeling worden opgeslagen. Voor elk gist-model dat moet worden onderzocht, kunnen gistcellen die de bibliotheek genen bevatten worden ontdooid uit de voorraad van glycerol en de screening kan worden gedaan door de paring met het model van de gist van belang in het tegenovergestelde paring type, dat wil zeggen, paring type een. Dit idee van het gebruik van de paring aan het samenbrengen van twee genen in gist is niet nieuw. Het is met succes toegepast in de gist van de high-throughput screening van de twee-hybride, in die een aas bouwen (dat wil zeggen, Gal4-DNA-bindende domein fusies) in één paring type is samengebracht door paring met een prooi construct uit een gekleed bibliotheek 12. deze strategie heeft echter nooit zijn toegepast in overexpressie bibliotheek vertoningen, die altijd gebruik van traditionele transformatie methoden gemaakt hebben.
Ons laboratorium gevestigd eerder een model van de gist van de ALS-geassocieerde proteïne FUS7. Door overexpressie bibliotheek screening met de transformatie methode ontdekten we vijf gist genen(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1en VHR1) die het redden van de toxiciteit van FUS wanneer overexpressie. Deze bevindingen werden onafhankelijk van elkaar met een gelijkaardige studie bevestigd door een andere groep8. hUPF1, een menselijke homolog van ECM32, werd later aan het onderdrukken van de toxiciteit in primaire neuronale cellen13 en in een diermodel van ALS14 ook aangetoond. Met behulp van deze vijf genen als bewijs van beginsel, we laten zien dat alle vijf genen ook FUS toxiciteit redden, wanneer zij worden binnengebracht in het model van de gist FUS door paring. Omdat gistcellen met de genen van de bibliotheek kunnen worden permanent in glycerol voorraad opgeslagen en nieuw leven ingeblazen wanneer nodig, zal deze paring gebaseerde methode de tijdrovende stap van transformatie telkens die de bibliotheek worden gescreend moet tegen verwijderen. Omdat de paring is zeer efficiënt met geen plasmide transformatie betrokken, vermindert deze strategie ook aanzienlijk de kosten in verband met reiniging en transformatie van een grote plasmide-bibliotheek. We zullen met succes deze methode toepassen op een bibliotheek screening tegen gist model van FUS.
De procedure voor paring gebaseerde screening wordt kort beschreven in Figuur 1. In eerste instantie is de gekleed plasmide-bibliotheek omgevormd tot een haploïde giststam van het type α met een hoge gegevensdoorvoer gist transformatie protocol waarin elk putje van een 96-wells-plaat gist getransformeerd met een specifieke bibliotheek plasmide bevat paring. Deze collectie van getransformeerde gist wordt opgeslagen als een glycerol voorraad die kan worden ontdooid en nieuw leven ingeblazen voor gebruik later. Het model van de gist van belang, in dit geval FUS toxiciteit, moet worden gegenereerd in een haploïde giststam met de tegenovergestelde paring type (type paring een). In een high-throughput wijze met behulp van steriele 96-pins replicators, zijn de FUS stam giststammen met de bibliotheek van de plasmide overgedragen aan 96-wells-platen met rijke media en kunnen van de stuurman. Na de paring, een klein volume van elk putje van de paring cultuur wordt overgedragen aan 96-wells-platen met synthetische dropout media in welke alleen diploïde gist met zowel de FUS en bibliotheek genen kunnen groeien. Een robotic spotten machine wordt vervolgens gebruikt voor het overzetten van gist cultuur van elk putje op agar platen waar de uitdrukking van FUS en de genen van de bibliotheek wordt geïnduceerd. Bovendien is gist cultuur gespot om agar platen waar FUS en de bibliotheek genen niet worden uitgedrukt. Na groei op agar platen, genen die redden of verergeren FUS toxiciteit worden geïdentificeerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een plasmide overexpressie scherm in gist met paring te introduceren de plasmide-bibliotheek in het model van de gist. Met behulp van deze aanpak, kunnen meerdere gist modellen van neurodegeneratieve ziekte eiwit toxiciteit worden gescreend met behulp van dezelfde collectie van gist getransformeerd met een plasmide-bibliotheek. Het moeizame proces van transformatie hoeft alleen te worden uitgevoerd zodra, na welke hoogefficiënte gist paring wordt gebruikt om de pla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de nadenkende gesprekken met leden van het Ju-laboratorium en Zhong laboratorium, en de financiële steun van de Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). 유전학. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer’s disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
