酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング
Summary
アレイ プラスミド ライブラリを使用して出芽酵母の発現スクリーニングを容易に交配に基づく手法を提案します。
Abstract
出芽酵母は、人間の病気と関連付けられる蛋白質の勉強にモデルとして広く使用されています。ゲノム遺伝学的スクリーニングは、酵母の研究でよく使用される強力なツールです。酵母における神経変性疾患関連タンパク質の発現を引き起こす細胞毒性と会合体形成、これらの障害を持つ患者で見られる所見をさたします。ここでは、その毒性の修飾子の筋萎縮性側索硬化症関連タンパク質 FUS の酵母モデルをスクリーニングするための手法について述べる。変換を使用する代わりにこの新しいスクリーニング プラットフォームは酵母酵母モデルへのプラスミド配列ライブラリの導入の合うことに依存しています。交尾のメソッドは 2 つの明確な利点: 最初に、それは非常に効率的な;第二に、プラスミドの変換前の配列ライブラリ格納できるグリセロール ストックとして長期の酵母モデルに変換の手間のかかるステップなし他の画面にすぐに適用されるたびに。このメソッドを正常に使用する方法を示す変更 FUS の毒性遺伝子のスクリーニングに。
Introduction
出芽酵母酵母は、直接人間の病気に関連して細胞のプロセスを理解する基本的な科学研究1で広く使用されています。さらに、それ使用されていますモデル生物として、最も一般的な神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側を含むにリンクなど、ヒトの疾患関連タンパク質を勉強横方向性硬化症 (ALS) の2。酵母モデルの利点は、ゲノム広い画面がこのように毒性のメカニズムへの洞察力を与えて、疾患関連蛋白質の毒性に関連する細胞の経路を識別するために行うことができます簡単です。このような 1 つの画面は、どの遺伝子が過剰に発現すると、毒性を変更できますを識別するために酵母のモデルに変換はそれぞれ配列ライブラリで 5,500 酵母遺伝子の過剰発現のライブラリ画面と呼ばれます。このスクリーニング法は、複数神経変性疾患関連蛋白質のハンチントン病3パーキンソン病4,5 α-シヌクレインの huntingtin を含む酵母モデルで正常に適用されています。、アルツハイマー病6FUS と ALS7,8,9の TDP 43 a β。通常、高スループット方法10で行われますが、画面の最も労働集約的なステップの 5,500 の酵母の遺伝子配列ライブラリから個別に変換です。上映が繰り返されるたびにこの手順を実行する必要がありするたびに新しく設立された酵母モデルは調査される必要性します。このタスクを実行するより効率的な方法を見つけることが重要です。
酵母は半数体と 2 倍体の両方の形態で安定に存在できます。交配交配型単相の細胞のタイプの反対の 2 つがある、および α。 各交配の細胞の倍加の食材を入力して反対側に嵌合型細胞のみが対応、独自の特定交尾フェロモンを分泌します。これはの間で合うことができますと α/α は、安定した二倍体細胞を生成する細胞。このプロセスは、自然と非常に効率的な11です。出芽酵母プラスミド ライブラリを紹介するこのユニークなライフ サイクルを利用することができます。具体的には、各遺伝子プラスミド配列ライブラリでは 1 つの交配型、すなわち、α 細胞の半数体の細胞に変換されます。ライブラリの遺伝子を含むこれらの細胞は、アレイの 96 ウェル フォーマットのグリセロール ストック保存されます。グリセロール ストックから、選別する必要がある各酵母モデルのライブラリ遺伝子を含む酵母細胞を解凍できるし、逆交配型,すなわち, 交配型の興味の酵母モデルとの交配によって、スクリーニングを行うことができます。酵母に一緒に 2 つの遺伝子を持って交配を使用してのこの考えは新しくないです。高スループット酵母ツーハイブリッド法、餌が 1 つの交配型 (すなわち、Gal4 DNA 結合ドメイン融合) 構築を一緒に配列ライブラリから獲物コンストラクトの交配によってもたらされる正常に適用されています。12します。 ただし、この戦略は決して過剰発現ライブラリ上映は、伝統的な変換方法は常に使用に適用されています。
私たちの研究室は以前 ALS 関連タンパク質 FUS7の酵母モデルを確立しました。変換法を用いた発現ライブラリ スクリーニングを通じて高い FUS の毒性を救う 5 つの酵母遺伝子 (ECM32、NAM8、SBP1、SKO1、およびVHR1) を発見しました。これらの所見が独立してによって確認された同様の調査で別のグループ8。hUPF1、 ECM32の人間の相同物は初代神経細胞13と ALS14と同様の動物モデルでの毒性を抑制して後で示されました。これらの 5 つの遺伝子を使用すると、原則の証拠として、交配による FUS 酵母モデルに導入している場合すべての 5 つの遺伝子が同様に FUS 毒性を救出を紹介します。ライブラリの遺伝子を含む酵母細胞はグリセロール ストックで永続的に保存でき、必要な時に復活、以来この交配に基づくメソッドの変換ライブラリに対して上映するたびに時間がかかるステップが削除されます。交尾は関与プラスミド変換効率が高いため、この戦略は精製と大型プラスミド ライブラリの変換に関連付けられているコストも大幅減少します。FUS の酵母モデルに対するスクリーニング ライブラリにこのメソッドが正常に適用されます。
交尾ベースのスクリーニングの手順は、図 1で簡単に説明します。当初は、アレイ プラスミド ライブラリは、96 ウェル プレートの各ウェルに特定のライブラリ プラスミドで形質転換酵母が含まれている高スループット イースト変形のプロトコルを使用して型 α を交配の半数体酵母に変換されます。変換された酵母のこのコレクションは、解凍して使用後に復活できるグリセロール ストックとして保存されます。反対の交配型と半数体酵母の関心は、このケースの FUS 毒性の酵母モデルを生成する必要が (交配型、)。滅菌の 96 ピン レプリケーターを使用して高スループット方法で FUS ひずみと酵母プラスミド ライブラリを含むがリッチ ・ メディアを含む 96 ウェル プレートに転送され、仲間にできます。次の交尾、それぞれから少量交尾文化の井戸が両方の FUS を含むどのだけ二倍体酵母の合成ドロップ アウト メディアを含む 96 ウェル プレートに転送され、ライブラリ遺伝子が成長することができます。ロボット スポッティング マシン、FUS およびライブラリ遺伝子の発現が誘導される寒天プレート上に各ウェルから酵母培養を転送する使用されます。 さらに、酵母培養は、FUS とライブラリ遺伝子が表現されてない寒天を制御する発見されます。次の寒天版で成長、救助または FUS 毒性を悪化させる遺伝子が識別されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、酵母モデルにプラスミド ライブラリを導入する交尾を用いた酵母プラスミド発現画面を実行するプロトコルについて述べる。このアプローチを使用すると、複数の酵母モデル神経変性疾患タンパク質毒性の酵母プラスミド ライブラリと変形の同じコレクションを使用して上映されます。変換の骨の折れるプロセスのみを非常に効率的な酵母後交尾がクエリひずみにプラスミド ラ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ライトの州立大学からの資金援助と忠所じゅ研究室のメンバーと思慮深い議論に感謝しています。
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
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