Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras
Summary
Este artículo presenta un método basado en el acoplamiento para facilitar la detección de sobreexpresión en levadura de florecimiento utilizando una biblioteca de plásmidos vestida.
Abstract
Levadura de florecimiento ha sido ampliamente utilizada como modelo en el estudio de proteínas relacionadas con enfermedades humanas. Investigación genética genoma es una poderosa herramienta de uso general en estudios de levadura. La expresión de un número de proteínas asociada a enfermedad de neurodegenerative en levadura causa citotoxicidad y formación de agregados, recapitulando los resultados vistos en pacientes con estos trastornos. Aquí, describimos un método para la detección de un modelo de la levadura de la proteína asociada a la Esclerosis Lateral Amiotrófica FUS para modificadores de su toxicidad. En lugar de usar la transformación, esta nueva plataforma de proyección se basa en el acoplamiento de la levadura para introducir una matriz biblioteca de plásmidos en el modelo de la levadura. El método de apareamiento tiene dos claras ventajas: en primer lugar, es muy eficiente; en segundo lugar, la biblioteca matriz previamente transformada de plásmidos puede almacenarse a largo plazo como un stock de glicerol, y rápidamente aplicada a otras pantallas sin el paso intensivo de transformación en el modelo de levadura cada vez. Nos demuestran cómo se puede utilizar con éxito este método para detectar genes que modifican la toxicidad de FUS.
Introduction
La levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada en la investigación científica básica1 para entender procesos celulares relacionados directamente con enfermedades humanas. Por otra parte, se ha utilizado como organismo modelo para estudiar proteínas humanas asociadas a la enfermedad, tales como los relacionados con las enfermedades neurodegenerativas más comunes, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y amiotrófica Esclerosis lateral (ALS)2. Una ventaja del modelo de la levadura es la facilidad con que se puede realizar una pantalla de genoma para identificar vías celulares relacionados con la toxicidad de las proteínas relacionadas con la enfermedad, dando la penetración en el mecanismo de su toxicidad. Una tal pantalla se llama una pantalla de biblioteca de sobreexpresión, en la que cada uno de los 5.500 genes de la levadura en una biblioteca matriz se transforma en un modelo de levadura a identificar qué genes pueden modificar la toxicidad cuando overexpressed. Este método de cribado se ha aplicado con éxito en los modelos de la levadura de múltiples neurodegenerative enfermedad proteínas asociadas, incluyendo huntingtina para la enfermedad de Huntington3, α-sinucleína para la enfermedad de Parkinson4,5 , Aβ para la enfermedad de Alzheimer6y FUS y TDP-43 para ALS7,8,9. Mientras que generalmente se realiza en un modo de alto rendimiento de10, el paso más trabajo de la pantalla está transformando individualmente 5.500 genes de la levadura de una biblioteca vestida. Este paso debe realizarse cada vez que la proyección se repite, y cada vez que un modelo de nueva levadura necesita ser estudiado. Es importante encontrar una manera más eficiente para llevar a cabo esta tarea.
Las células de levadura estable pueden existir en formas haploides y diploides. Hay dos opuestos tipos de células haploides, acoplamiento tipo de apareamiento a y α. células haploides de cada apareamiento tipo producir y secretan su propia feromona apareamiento específico, que sólo las células de tipo acoplamiento opuesto responden. Esto permite el acoplamiento entre una y las células α producen células diploides estables, a/α. Este proceso es espontáneo y altamente eficaz11. Podemos aprovechar este ciclo de vida único de S. cerevisiae para presentar la biblioteca de plásmido. Más específicamente, cada gen en la biblioteca de plásmido vestida se transformarán en células haploides de un tipo de cruzamiento, es decir, la célula α. Estas células que contienen los genes de la biblioteca se almacenará en stock de glicerol en un formato matriz de 96 pocillos. Para cada modelo de levadura que necesita ser defendido, las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser descongeladas del stock de glicerol, y la proyección puede realizarse a través de acoplamiento con el modelo de levaduras de interés en el acoplamiento tipo opuesto, es decir, tipo de cruzamiento una. Esta idea de la utilización de apareamiento para reunir a dos genes en la levadura no es nueva. Se ha aplicado con éxito en la levadura de alto rendimiento, proyección de dos híbridos, en que un cebo construir (es decir, fusiones de dominio Gal4-DNA-que atan) en un tipo de cruzamiento se reúne a través de apareamiento con una construcción de la presa de una biblioteca vestida 12. sin embargo, esta estrategia no se ha aplicado nunca en proyecciones de la biblioteca de sobreexpresión, que siempre han utilizado métodos de transformación tradicional.
Nuestro laboratorio había establecido previamente un modelo de levadura de la proteína asociada a ALS FUS7. A través de la proyección de la biblioteca de sobreexpresión utilizando el método de transformación descubrieron cinco genes de levadura (NAM8, SBP1, ECM32, SKO1y VHR1) que rescatan toxicidad de FUS cuando overexpressed. Estos resultados fueron confirmados independientemente con un estudio similar realizado por otro grupo8. hUPF1, un homólogo humano de ECM32, más adelante fue demostrado que suprimen la toxicidad en las células neuronales primarias13 y en un modelo animal de ALS14 así. Utilizando estos cinco genes como prueba del principio, demostramos que todos los cinco genes asimismo rescatar toxicidad FUS cuando se introducen en el modelo de la levadura FUS por apareamiento. Puesto que las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser almacenadas permanentemente en stock de glicerol y revivió cuando sea necesario, este método basado en apareamiento eliminará el paso lento de transformación cada vez que necesita ser defendido contra la biblioteca. Apareamiento es altamente eficiente con ninguna transformación del plásmido involucrado, esta estrategia disminuye también significativamente el costo asociado con la purificación y transformación de una biblioteca de plásmidos grandes. Con éxito se aplicará este método en una biblioteca de investigación contra el modelo de la levadura de FUS.
El procedimiento basado en el acoplamiento se describe brevemente en la figura 1. Inicialmente, la biblioteca de plásmido vestida se transforma en una cepa de levadura haploide de acoplamiento tipo α mediante un protocolo de transformación de levaduras de alto rendimiento en el que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contiene levadura transformada con un plásmido de la biblioteca específica. Esta colección de levadura transformada se guarda como un stock de glicerol que puede ser descongelado y revivido para el uso más adelante. El modelo de levaduras de interés, en este caso toxicidad FUS, debe generarse en una cepa de levadura haploide con el tipo de apareamiento opuesto (acoplamiento tipo a). En alto rendimiento forma con estériles replicadores de 96 pines la cepa FUS cepas de levadura que contiene la biblioteca de plásmido transferidas a placas de 96 pocillos que contienen medios enriquecidos y permitió a mate. Tras el apareamiento, un pequeño volumen de cada bien de la cultura de acoplamiento se transfiere a placas de 96 pocillos que contienen medios sintéticos deserción que levadura sólo diploide que contiene tanto las FUS y genes biblioteca pueden crecer. Una máquina telescopio robótica entonces se utiliza para transferir la cultura de la levadura de cada pozo en placas de agar donde se induce la expresión de los genes de la biblioteca y FUS. Además, cultura de la levadura es descubierta para controlar las placas de agar donde FUS y los biblioteca los genes no se expresan. Después de crecimiento en placas de agar, se identificarán genes que rescataran o exacerban la toxicidad FUS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un protocolo para realizar una pantalla de sobreexpresión de plásmido en la levadura mediante apareamiento para introducir la biblioteca del plásmido en el modelo de la levadura. Usando este acercamiento, pueden proyectará varios modelos de levadura de la toxicidad de la proteína enfermedad neurodegenerativas utilizando la misma colección de levadura transformada con una biblioteca de plásmidos. El laborioso proceso de transformación sólo necesita realizarse una vez, después de que levadura a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos por las discusiones reflexivas con miembros del laboratorio Ju y laboratorio de Zhong y el apoyo financiero de la Universidad de estado de Wright.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
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