Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama
Summary
Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.
Abstract
Mayası yaygın insan hastalıkları ile ilişkili proteinler eğitim bir model olarak kullanılmıştır. Genom genelindeki genetik tarama Maya çalışmalarda yaygın olarak kullanılan güçlü bir araçtır. Nörodejeneratif hastalık ilişkili proteinler Maya bir dizi ifade sitotoksisite ve toplama oluşumu, bu bozuklukları olan hastalarda görülen bulguları recapitulating neden olur. Burada, bir Maya model değiştiriciler, toksisite için amyotrofik Lateral skleroz ilişkili protein FUS süzmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Dönüştürme kullanmak yerine, bu yeni tarama platform plazmid dizilmiş bir kütüphane Maya modeli tanıtmak için Maya çiftleşme üzerinde dayanır. Çiftleşme yöntemi iki açık avantajları vardır: Birincisi, yüksek verimli; İkinci olarak, önceden dönüştürülmüş dizilmiş kütüphanede plazmidleri, bir gliserol hisse senedi olarak uzun vadeli ve diğer ekranların Maya modeline dönüştürme adım emek yoğun olmadan hızlı bir şekilde uygulanan her zaman saklanır. Biz nasıl bu yöntem başarıyla kullanılabileceğini göstermek için ekran FUS toksisite değiştirmek genler.
Introduction
Tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae hücresel süreçler doğrudan insan hastalıkları ile ilgili anlamak için temel bilimsel araştırma1 ‘ de yaygın olarak kullanılmıştır. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve amyotrofik dahil olmak üzere en yaygın nörodejeneratif hastalıklar için bağlı olanlar gibi insan hastalık ilişkili proteinler eğitim için Ayrıca, bu bir model organizma kullanılmıştır Lateral skleroz (ALS)2. Maya modelin bir avantajı ile Genom geniş perde böylece onların toksisite mekanizmasının içine fikir veren proteinler, hastalığı ile ilgili toksisitesi ile ilgili hücresel yolları tanımlamak için gerçekleştirileceği kolaylığıdır. Böyle bir ekran içinde her dizilmiş bir kütüphanede 5.500 Maya genlerin hangi genlerin overexpressed zaman toksisite değiştirebilirsiniz tanımlamak için bir Maya modeli olarak dönüştürülür bir overexpression kitaplık ekranı denir. Proteinlerin huntingtin Huntington hastalığı3, α-synuclein Parkinson hastalığı4,5 için için de dahil olmak üzere birden çok nörodejeneratif hastalık ilişkili, Maya modellerinde bu tarama yöntemi başarıyla uygulandı , Aβ Alzheimer hastalığı6ve FUS ve TDP-43 ALS7,8,9. Genellikle bir yüksek-den geçerek şekilde10dakika sonra yapılır iken, ekranın en emek yoğun adım tek tek dizilmiş kitaplıktan 5.500 Maya genler dönüştürüyor. Bu adım her zaman tarama tekrarlanır gerçekleştirilmesi gerekir ve ne zaman yeni kurulan Maya manken belirlenmesi gerekiyor. Bu görevi yerine getirmek için daha verimli bir yol bulmak önemlidir.
Maya hücreleri haploit ve diploit formlarında stabil bulunabilir. İki haploit hücreleri, türü çiftleşme türleri çiftleşme karşısında bir ve her çiftleşme α. haploit hücreleri yazın üretmek ve için yalnızca ters çiftleşme türü hücreleri yanıt kendi belirli çiftleşme feromon salgılar. Bu arasında çiftleşme sağlar bir ve α hücreleri istikrarlı diploit hücreleri, bir/α üretmek için. Bu işlem kendiliğinden ve yüksek verimli11yaşında. Biz plazmid Kütüphane tanıtmak S. cerevisiae bu benzersiz yaşam döngüsünün yararlanabilirsiniz. Daha ayrıntılı olarak, her gen dizilmiş plazmid kütüphanede bir çiftleşme türü, yani, α hücre haploit hücreleri dönüştürülür. Kütüphane genleri içeren bu hücreler sonra gliserol stok dizilmiş 96-iyi biçimde depolanır. Taranması gereken her Maya model için Kütüphane genleri içeren Maya hücreleri gliserol stoktan çözdürülen ve tarama ters çiftleşme türü, yani, çiftleşme ilgi Maya modeli ile çiftleşme yoluyla yapılabilir bir. Maya iki gen getirmek birlikte çiftleşme kullanarak bu fikri yeni bir şey değil. İki-hibrid tarama, hangi bir yem oluşturmak (yani, Gal4 DNA’ya bağlanıcı etki alanı füzyon) bir çiftleşme yazıyla birlikte dizilmiş kitaplıktan bir av yapısı ile çiftleşme aracılığıyla getirilir yüksek üretilen iş Maya içinde başarıyla uygulandı 12. ancak, bu strateji asla her zaman geleneksel dönüşüm yöntemleri kullandım overexpression Kütüphane gösterimleri uygulanmıştır.
Bizim Laboratuvar Maya manken ALS ilişkili protein FUS7‘ nin daha önce kurulmuş. Dönüşüm yöntemi kullanarak overexpression Kütüphane tarama yoluyla overexpressed zaman FUS toksisite kurtarmak beş Maya genlerin (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1ve VHR1) keşfetti. Bu bulgular bağımsız olarak başka bir grup8tarafından benzer bir çalışma ile teyit edildi. hUPF1, ECM32, insan bir homolog daha sonra toksisite birincil nöronal hücre13 ‘ te ve ALS14 de hayvan modelinde bastırmak için gösterildi. Bu beş genlerin ilke kanıtı olarak kullanarak, çiftleşme tarafından FUS Maya modeli tanıtıldı zaman tüm beş genler benzer şekilde FUS toksisite kurtarmak göstermektedir. Maya hücreleri Kütüphane genleri içeren kalıcı olarak saklanan gliserol stokta ve gerektiğinde yeniden canlandırdı beri bu çiftleşme tabanlı yöntem dönüştürme karşı taranması için Kütüphane ihtiyacı her zaman zaman alan adım kaldırır. Çiftleşme herhangi plazmid bir dönüşüm dahil yüksek verimli olduğundan, bu strateji arıtma ve dönüşümü, bir büyük plazmid Kütüphane ile ilgili maliyet de önemli ölçüde azaltır. FUS Maya modeli karşı eleme bir kitaplığı başarıyla bu yöntem uygulanır.
Çiftleşme tabanlı tarama prosedürü kısaca Şekil 1‘ de anlatılan. Başlangıçta, dizilmiş plazmid kitaplık türü α her şey bir 96-şey plaka belirli kitaplık plazmid ile dönüştürülmüş Maya içeren bir yüksek-den geçerek Maya dönüştürme iletişim kuralı kullanılarak çiftleşme haploit Maya süzün içine aktarılır. Bu koleksiyon dönüştürülmüş Maya çözdürülen ve kullanım için daha sonra canlanan bir gliserol stok olarak kaydedilir. İlgi bu durumda FUS toksisitesi, Maya model haploit Maya gerilme zıt eşleşme türü ile oluşturulan gerekir (türü çiftleşme bir). Steril 96-pin Çoğalıcılar kullanarak bir yüksek-den geçerek şekilde FUS zorlanma ve maya suşları plazmid kitaplığı içeren zengin medya içeren 96-şey plakaları için transfer ve mate için izin. Çiftleşme, her küçük bir birimden takip iyi çiftleşme kültürünün 96-şey plakalar sentetik çıkarma medyada her iki FUS içeren hangi sadece diploit Maya içeren aktarılmasına ve Kütüphane genler büyüyebilir. Bir robot edindiği makine sonra Maya kültür üzerine ağar kaplamalar ve daha nerede FUS ve Kütüphane genlerin ifadesi indüklenen her kuyudan aktarmak için kullanılır. Ayrıca, Maya kültür nerede FUS ve Kütüphane genler değil ifade edilir ağar kaplamalar denetlemek için fark edilir. Ağar kaplamalar üzerinde büyüme kurtarma veya FUS toksisite azdırmak genlerin tespit edilecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, plazmid overexpression ekran Maya plazmid Kütüphane Maya modeli tanıtmak için çiftleşme kullanarak gerçekleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu yaklaşımı kullanarak, birden fazla Maya modeli nörodejeneratif hastalık protein toksisite Maya bir plazmid kitaplıkla dönüştürdü aynı koleksiyonunu kullanarak gösterimi. Dönüşüm zahmetli süreci sadece sonra hangi yüksek verimli Maya çiftleşme plazmid kitaplığı sorgu yük tanıtmak için kullanılan bir kez yapılması gerekir. Bu ile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz üyeleri Ju laboratuvar ve Zhong laboratuvar ve finansal destek Wright State Üniversitesi’nden düşünceli tartışmalarla için müteşekkir.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). 유전학. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer’s disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
