Summary
为了扩大全世界实验室的能力, 以可靠和可重复的方式评估肺癌患者接受 pembrolizumab 治疗的资格, 我们开发了一种使用22C3 抗体集中于广泛应用的检测方法。免疫组化 autostainer, 用于活检和细胞学标本。
Abstract
Pembrolizumab 单药疗法已被批准为一线和二线治疗 PD-L1-expressing 晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者。用 PD-L1 免疫组化 (IHC) 22C3 伴侣诊断法 (PD-L1) 对肿瘤组织进行了实验验证。我们开发了一个优化的实验室开发的测试 (LDT), 使用22C3 抗体 (Ab) 集中在广泛可用的 IHC autostainer 活检和细胞学标本。对 PD-L1 TPS 进行了120配对全肿瘤组织切片和活检标本, 并与70配对活检和细胞学标本 (支气管洗涤, n = 40; 胸腔积液, n = 30)。22C3 Ab 精矿为基础的 LDT 表明, 活检 (~ 100%) 和细胞学 (~ 95%) 标本之间的高协调率, 与 PD-L1 IHC 表达式确定使用 PD-L1 IHC 22C3 同伴化验在两个 TPS 切割点 (≥1%, ≥50%)。在这里提出的优化 LDT, 利用 22C3 Ab 精矿来确定在肿瘤组织和细胞学标本中的 PD-L1 表达, 将扩大全球实验室的能力, 以评估肺癌患者的资格, 以治疗与pembrolizumab 以可靠和可重现的方式进行单一疗法。
Introduction
最近的临床试验证明 pembrolizumab 是一种人性化的单克隆 IgG4 同种抗体, 它阻断了程序性细胞死亡 1 (PD-1) 及其配体、PD-L1 和 PD-L2 之间的相互作用, 在治疗患者中先进的 NSCLC1,2,3,4。
目前, pembrolizumab 被批准用于治疗 PD-L1-expressing 非细胞肺癌的治疗-天真的患者 PD-L1 表达 TPS 的≥50% 和没有表皮生长因子受体 (EGFR) 或变性淋巴瘤激酶 () 基因组肿瘤畸变3对以前治疗过的病人用 PD-L1 TPS 的≥1%1。
PD-L1 蛋白表达 IHC 被广泛应用于 anti-PD-1/PD-L1 治疗的预测生物标志物检测。在 pembrolizumab 临床试验中, 使用 PD-L1 IHC 22C3 辅助试验5测定了用福尔马林固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织样品获得的 PD-L1 TPS。这项化验已获美国食品及药物管理局 (FDA) 批准, 并已在欧洲 CE 标记, 以确定肿瘤 PD-L1 TPS5。
各机构为可靠和高质量地评估 PD-L1 TPS 与使用22C3 抗体浓缩物的 LDTs 提供了更多的全球选择, 这对于支持有关患者资格的临床决定是必不可少的 pembrolizumab治疗。大量病理学实验室无法获得伴侣诊断 PD-L1 IHC 22C3 检测。因此, 开发可靠和一致的 LDTs 兼容其他, 广泛可用的 IHC autostainer 平台是必不可少的。
此外, 有必要建立 LDTs 使用细胞学标本, 是唯一的标本类型经常可用的 NSCLC 患者。PD-L1 IHC 22C3 伴侣检测是验证切除, 核心针活检, bronchoscopies 只有当支气管镜产生100肿瘤细胞。虽然这些样本类型经常获得, 细胞学样本更容易收集, 是最常见的样本类型在一些机构6,7。然而, 目前尚无经证实的诊断化验方法可用于评价细胞学标本中的 PD-L1 表达;与细胞学样品兼容的可靠 LDTs 将进一步促进高质量的 PD-L1 测试。
此外, 在建立 LDT 的临床验证时, IHC 应与相应的临床验证的商业试验8进行类似的操作。例如, 应该验证几个关键步骤, 以获得相同的信号序列部分, 如抗体滴定, 预处理延迟, 孵化时间, 和放大系统9。
我们最近开发了一个优化 LDT, 使用22C3 抗体精矿评价 PD-L1 表达的肿瘤活检和细胞学标本10,11。我们发现与 LDT 的高一致性与 "金标准" PD-L1 IHC 22C3 测定10,11。此临床验证的协议将支持全球范围内可靠、高质量的 PD-L1 测试。
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Protocol
所有程序都已通过地方道德委员会 (人类研究道德委员会, 中心 Hospitalier Universitaire 尼斯/Tumorothèque BB-0033-00025) 批准。
注: 本协议是专门调整, 以使用22C3 抗体集中在商业上可用的自动 IHC 着色器 (称为 autostainer 在这里, 见材料表) 的肿瘤活检和细胞学标本。
1. 肿瘤组织标本的制备
- 将10% 中性缓冲福尔马林 (NBF) 中的肿瘤组织固定在卡带中。
注: 近端肺肿瘤的肿瘤组织一般由支气管镜检查, 由 pulmonologist 或肺专家在适度镇静下进行。为周围病变和弥漫性肺部疾病, 支气管或针活检表示。这些程序通常在手术室或重症监护病房进行。 - 将卡带嵌入石蜡中。
注: 经解剖后立即灌注或浸泡可达到固定, 通常需要 8–10 h。固定容积应15–20x 高于试样体积。不建议将活检组织修复超过10小时, 因为 overfixation 会引起抗原的掩蔽。在室温下, 固定速度约为1毫米/小时。 - 在组织处理器中用蜡渗入固定组织样品 (见材料表)。
注: 脱水是在三酒精浴, 增加浓度 70%, 85% 和90% 进行。水最后被三最后绝对酒精浴去除。清除在三甲苯浴和蜡渗透在热的蜡浴 (44–60°c) 执行。 - 在充满熔融石蜡的模具内嵌入组织 (见材料表), 等待凝固。
- 切片的石蜡嵌入组织在厚度为3微米的切片。
- 将石蜡带转移到正电荷的显微镜玻璃滑梯上 (见材料表)。
- 干燥幻灯片1小时在37°c。
注: 将组织切片存放在2–8°c (首选) 或室温可达25摄氏度, 以保持抗原性, 并在切片15维内染色。
2. 细胞学样品的制备
-
在防腐剂溶液中收集支气管洗涤液 (见材料表)。
注: 为此, 采用标准支气管镜技术。- 灌洗支气管的分布进行取样。在干净的容器里收集洗涤。用患者的姓氏、出生日期和标本来源对容器进行标签。
- 将支气管洗涤液转移到50毫升锥形管中, 加入2克的 dl-Dithiothreitol 粉 (见材料表), 涡流管30分钟, 然后将其离心在 250 x g处, 室温下为5分钟。
- 除去上清, 并添加10毫升的 mucolytic 溶液 (见材料表)。
- 在中等速度 (9 级) 的情况下, 将样品摇动20分钟, 室温下将其离心在 250 x g处进行5分钟。
- 取出上清液并将细胞颗粒存放在含有 10% NBF 的收集管中。
- 添加4滴细胞块制备试剂 (见材料表) 到细胞颗粒。
- 将细胞小球转移到卡带上, 将其固定在 10% NBF 中, 并将其石蜡嵌入细胞块准备和切片 (见步骤 1.1–1.7)。
3. PD-L1 染色法
- 打开 autostainer 和计算机。
- 双击 "autostainer" 图标, 然后选择用户。
- 点击 '创建标签 ' , 然后在' 协议 '。
- 双击22C3 协议。
注意: 该协议首先安装在 autostainer 的计算机上, 点击"创建协议"。完整的协议作为补充文件 1提供。 - 把病人的身份证写在标签上, 然后点击"打印"。
- 将标签贴在幻灯片上。
- 按所选抽屉的按钮打开幻灯片抽屉。
- 将标记的幻灯片放在热垫上, 标签朝上, 向内。
- 关闭幻灯片抽屉。
- 从分配器上取下瓶盖, 在试剂架上装上试剂。
- 打开着色器的引擎盖, 把架子放在试剂的卡鲁塞尔上, 确保它们适合并保持在原位。
- 关上引擎盖。
- 在软件上, 单击将使用的仪器, 然后单击"运行"。
- 在 IHC 过程的末尾, 用自来水和一滴清洁液冲洗幻灯片几秒钟。
- 水化幻灯片与一浴乙醇100% 和第二浴乙醇95% 几秒钟。
- 将幻灯片放到 coverslipping 机中, 以自动加载盖玻片。
4. PD-L1 染色的解释
注: 合格的病理学家应执行 PD-L1 IHC 试验的解释。
- 通过分析患者标本检查前的阳性和阴性对照, 评估 PD-L1 染色的质量。
注: 如果控制的染色不能接受, 则在患者标本上获得的结果被认为无效。 - 在显微镜下确认至少有100种活肿瘤细胞存在。
注: 当患者标本的肿瘤细胞少于100时, 报告。 - 在低放大率 4X, 评估所有保存完好的阳性和阴性肿瘤区域。
注: 在低放大倍数下, 部分膜染色或弱强度 (1 +) 的膜染色可能难以辨认。 - 分部分或完整的细胞膜染色。
注意: 细胞质染色必须排除在解释之外。 - 通过评估 PD-L1 阳性肿瘤细胞相对于保存完好的肿瘤区域内所有肿瘤细胞的比例来计算 TPS。
注意: 只有存活的肿瘤细胞才应该被检查。所有其他细胞元素, 如免疫细胞、坏死细胞、正常细胞和工件, 都必须排除在检查之外。
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Representative Results
使用此处介绍的过程, 如本组最近出版物10、11中详细描述的那样, 优化后的 LDT 经临床验证, 120 份档案 FFPE 细胞肺癌患者经手术治疗后活检标本在巴斯德大学医院切除或活检, 尼斯, 在2007年3月和2016年3月之间。此外, 为了评价细胞学样品的 PD-L1 表达, TPS 在70配对组织活检样品和细胞块, 由支气管洗涤 (n = 40) 或胸腔积液 (n = 30) 进行评估 (在巴斯德收集大学医院, 尼斯, 在2014年7月和2016年11月之间)。所有的幻灯片都在24小时内被新鲜的切割和染色。
22C3 抗体精矿 (LDT) 与 PD-L1 IHC 22C3 配合物测定 (金标准) 相比, 有代表性的染色模式, 如图 1A和1B所示。使用≥1% 的 tps, 54/120 例 (45%) PD-L1 阳性, 而使用≥50% 的 tps, 29/120 例 (24%) 被认为是阳性 PD-L1。
组内相关系数 (ICC) 用来衡量 TPS 评分作为一个连续变量的相关性是在 LDT 和黄金标准之间的99%。使用≥1% 和≥50% 的 TPS 裁减点, interpathologist 协议的κ分数在 LDT 平台内等于1。
与 PD-L1 IHC 22C3 试剂盒 (金标准) 相比, 用细胞学标本22C3 抗体 LDT 的典型染色模式如图 1C和1D所示。使用≥1% 和≥50% 的 tps 切口点之一 LDT 70 对活检和细胞学样品的协调率大于 95%, 而使用 tps 评分作为连续变量的 ICC 在0.88 和0.90 之间。这一发现是一致的每种类型的细胞学标本 (胸腔积液与支气管冲洗) 或肿瘤组织学 (腺癌与鳞状细胞癌) 与 ICC 在0.82 和0.96 之间。当比较 PD-L1 tps 37 (70) 对细胞学样品与 LDT 的活检样本与金标准, 使用≥1% tps 或≥50% TPS 削减点的协调率大于 97%, ICC 是在0.93 和0.95 之间。
图 1: 使用22C3 抗体精矿 (LDT) 与 PD-L1 IHC 22C3 试剂盒 (金标准) 相比, 活检和细胞学标本的代表性染色模式.(A) 本小组显示了用于肿瘤活检的 PD-L1 IHC 22C3 试验。(B) 本小组用22C3 抗体浓缩术从同一个肿瘤活检中分析的 LDT 中, 对该组进行了优化。(C) 本小组在一个细胞块中显示 PD-L1 IHC 22C3 化验。(D) 此面板显示了使用22C3 抗体浓缩器从同一个细胞块中分析的同一个单元格C中的 LDT 优化的方法。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
我们通过与相应的临床验证的商业试验10、11进行比较, 验证了使用 22C3 PD-L1 抗体精矿进行优化的 LDT。22C3 集中抗体为基础的 LDT 在活检 (~ 100%) 和细胞学 (~ 95%) 标本之间的一致性高, 与 PD-L1 tps 和 IHC tps 切割点22C3 ≥1% 试验确定的 PD-L1 IHC 表达式比较。正如国际肺癌研究协会最近建议的那样, PD-L1 阳性区域应相同, 大约 10 PD-L1 阴性样本, 10 PD-L1 阳性样本, 20 个样本覆盖线性动态范围的临床验证 PD-L1 IHC 试验8。我们对120例活检和70个细胞学标本进行了验证研究。总的来说, 一致性很高, 独立于 TPS 的阳性, 标本类型, 或肿瘤组织学。在这里提出的研究结果与先前其他研究表明, 组织和细胞学标本12、13、14、15的一致性高。
在本研究中, 所有标本均固定在 10% NBF。我们没有评估其他护的影响, 而对其他非福尔马林护如酒精基护的 PD-L1 染色的影响目前尚未探索。存在的免疫细胞表达 PD-L1, 特别是巨噬细胞, 需要仔细解释细胞学标本。这些样品必须参考序列苏木精和红梅幻灯片, 并在一些困难的情况下, 补充污渍, 以评估免疫细胞可以执行排除任何误解的 PD-L1 表达的肿瘤细胞只。
这项研究包含了一些局限性, 包括一个单一机构的回顾性分析, 以及没有病人接受 pembrolizumab 来评估临床结果的事实。此外, 在这里提出的 LDT 的一个小限制涉及颗粒染色模式, 有时观察时, 使用放大系统, 这可能使他们的解释更困难。此外, 免疫细胞的染色模式比黄金标准所观察到的要强烈一些。病理学的训练是必要的, 以获得正确的解释 PD-L1 染色与 IHC。16
在临床环境中, LDTs 的健壮性需要通过寻求认证和认证, 遵循标准的操作程序, 并定期参加外部质量评估计划8来保持。只有当这些先决条件完成8, 才能保证临床预测性能。
这里提出的协议解决了 PD-L1 LDTs 在活检和细胞学样品的关键需要, 当分析在一个广泛的可利用的 autostainer 跨地理区域, 可能不配备金标准化验。本文采用22C3 抗体精矿对 LDT 进行了优化, 可用于对 NSCLC 患者的活检和细胞学标本的 PD-L1 表达进行评价。这将大大扩大可以提供高质量 PD-L1 测试的实验室数量, 以确定有资格接受 pembrolizumab 单药治疗的非肺癌患者, 其可靠性和可重复性。
一个潜在的未来方向是评估使用其他细胞学标本类型 (例如, 从细针活检标本, 支气管镜引导穿刺活检, 支气管超声引导穿刺活检, 支气管刷子) 与22C3 抗体的可行性以浓缩为主的 LDTs。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由美国新泽西州凯尼尔沃思默克 & 公司赞助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
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