Summary
For å utvide evnen til laboratorier over hele verden for å vurdere kvalifiseringskravene for pasienter med lungekreft behandling med pembrolizumab, på en pålitelig og reproduserbar måte, utviklet vi en analyse som bruker 22C 3 antistoff konsentrat på en allment tilgjengelig Immunohistochemical autostainer, for både biopsi og cytologi prøver.
Abstract
Pembrolizumab monoterapi er godkjent for første - og andre-linje behandling av pasienter med PD-L1-uttrykke avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Testing av PD-L1 uttrykk med PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C 3 følgesvenn diagnostiske analysen, som gir en svulst andel score (TPS), har blitt validert på tumor vev. Vi utviklet en optimalisert laboratorium utviklet test (LDT) som bruker 22C 3 antistoff (Ab) konsentrat på en allment tilgjengelig IHC autostainer for biopsi og cytologi prøver. PD-L1 TPS ble evaluert med 120 sammenkoblede hele-tumor vev deler og biopsi prøver og med 70 sammen biopsi og cytologi eksempler (bronkial vasker, n = 40; pleural effusions, n = 30). 22C 3 Ab konsentrat-baserte LDT viste et høyt for overensstemmelse mellom biopsi (~ 100%) og cytologi (~ 95%) prøver i forhold til PD-L1 IHC uttrykk bestemmes ved hjelp av PD-L1 IHC 22C 3 følgesvenn analysen på begge TPS kuttet poeng (≥1%, ≥50%). Optimalisert LDTEN presenteres her, bruker 22C 3 Ab konsentrat til å bestemme PD-L1 uttrykket i begge tumor vev og cytologi prøver, vil utvide evnen til laboratorier over hele verden for å vurdere kvalifiseringskravene for pasienter med NSCLC for behandling med pembrolizumab monoterapi på en pålitelig og reproduserbar måte.
Introduction
Siste kliniske studier har bevist effekten av pembrolizumab, et humanized monoklonalt IgG4 kappa isotype antistoff som blokkerer samspillet mellom programmert celledød 1 (PD-1) og dens ligander, PD-L1 og PD-L2, i behandling av pasienter med Avansert NSCLC1,2,3,4.
Foreløpig er pembrolizumab godkjent for behandling av PD-L1-uttrykke NSCLC i begge behandling-naive pasienter med en PD-L1 uttrykk TPS ≥50% og ingen epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) eller anaplastisk lymfom kinase (ALK) genomisk svulst avvik3 og for tidligere behandlet pasienter med en PD-L1 TPS ≥1%1.
PD-L1 protein uttrykk oppdaget av IHC har vært mye brukt som en prediktiv biomarkør analysen anti-PD-1/PD-L1 terapi. I pembrolizumab kliniske forsøk identifiserte PD-L1 TPS med formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vevsprøver bruker PD-L1 IHC 22C 3 følgesvenn analysen5. Denne analysen har blitt godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) og er CE-merket i Europa for fastsettelse av svulsten PD-L1 TPS5.
Globale tilleggsalternativer over institusjoner for pålitelig og høy kvalitet vurderinger av PD-L1 TPS med LDTs som bruker 22C 3 antistoff konsentrat er avgjørende for å støtte klinisk beslutninger om pasienten valgbarhet for pembrolizumab behandling. Et stort antall rutinelaboratorier har ikke tilgang til følgesvenn diagnostiske PD-L1 IHC 22C 3 analysen. Derfor er utviklingen av pålitelig og konsekvent LDTs kompatibel med ekstra, allment tilgjengelig IHC autostainer plattformer viktig.
Videre er det behov for å etablere LDTs cytologi utvalg som er den eneste prøven ofte tilgjengelig fra NSCLC pasienter. PD-L1 IHC 22C 3 følgesvenn analysen er godkjent for resections, kjernen nål biopsier og bronchoscopies hvis bronkoskopi gir 100 kreftceller. Selv om typene over eksempel hentes ofte, cytologi eksempler er lettere samlet og er den mest tilgjengelige utvalget i noen institusjoner6,7. Men er det ikke validert diagnostiske analysen tilgjengelig for vurdering av PD-L1 uttrykket i cytologi eksempler; pålitelig LDTs kompatibel med cytologi eksempler vil ytterligere lette høykvalitets PD-L1 testing.
Videre bør etablering klinisk valideringen av en LDT, IHC utføres når på en lignende måte til tilsvarende klinisk godkjent kommersielle test8. Flere kritiske trinn bør for eksempel kontrolleres for å få samme signal i seriell delene som antistoff titrering, forbehandling forsinkelser, inkubasjonstiden og forsterkning systemer9.
Vi har nylig utviklet en optimalisert LDT som bruker 22C 3 antistoff konsentrat evaluere PD-L1 uttrykket på svulst biopsier og cytologi eksempler10,11. Vi fant en høy overensstemmelse med den LDT versus "gullstandarden" PD-L1 IHC 22C 3 analysen10,11. Denne klinisk godkjent protokollen støtter pålitelig, høy kvalitet PD-L1 testing på tvers av områder globalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av den lokale etikk (menneskelige forskning komité, sentrum Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Merk: Denne protokollen er spesielt justert for bruk av 22C 3 antistoff konsentrat på en kommersielt tilgjengelig automatisert IHC fargemaskin (referert til som autostainer her, se Tabellen for materiale) for svulst biopsier og cytologi eksempler.
1. forberedelse av svulst
- Fastsette tumor vev i 10% nøytral bufrede formalin (NBF) i en kassett.
Merk: Tumor vev fra proksimale lunge svulst oppnås vanligvis ved bronkoskopi, utført under moderat sedasjon av en pulmonologist eller lunge spesialist. For eksterne lesjoner og diffus lungesykdom angis en transbronchial eller nål biopsi. Disse prosedyrene er vanligvis gjort i detKirurgi eller intensivavdelingen. - Bygge inn kassetten i parafin.
Merk: Fiksering kan oppnås ved perfusjon eller nedsenking umiddelbart etter disseksjon, og vanligvis krever 8-10 h. Etappe, den stabiliserende volumet skal 15-20 x høyere enn prøven. Det anbefales ikke å fikse biopsi vev for mer enn 10 h, fordi overfixation kan forårsake maskering av antigen. Fiksering hastigheten er ca 1 mm/h ved romtemperatur. - Infiltrere fast vev prøven med voks i vev prosessoren (se Tabell for materiale).
Merk: Dehydrering er utført i tre alkohol bad med økende konsentrasjoner 70% og 85% 90%. Vann er til slutt fjernet av tre siste absolutt alkohol bad. Oppryddingen utføres i tre toluen bad og voks infiltrasjon i varm voks bad (44-60 ° C). - Bygge inn vevet i en mold fylt med flytende parafin (se Tabell for materiale) og vente på herding.
- Delen parafin-embedded vev på en tykkelse på 3 μm på en mikrotom.
- Overføring parafin båndet til et positivt ladet mikroskop glass skyve (se Tabell for materiale).
- Tørr lysbildet 1t på 37 ° C.
Merk: Oppbevar delene vev på 2-8 ° C (foretrukket) eller ved romtemperatur opptil 25 ° C å bevare antigenicity, og flekker innenfor 15 d for vevsavfall.
2. utarbeidelse av cytologi eksempler
-
Samle bronkial vasker i en konserveringsmiddel løsning (se tabell for materiale).
Merk: For dette standard bronkoskopi teknikken brukes.- Lavage distribusjon av bronchus som skal avsøkes. Samle vask i en ren beholder. Etiketten beholderen med pasienten fornavn og etternavn, fødselsdato, og prøven kilden.
- Overføre bronkial vasker slik 50 mL koniske og legge 2 g DL-Dithiothreitol pulver (se Tabell for materiale), vortex tube i 30 min, og deretter virvel det 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern nedbryting og tilsett 10 mL av en mucolytic løsning (se Tabell på materiale).
- Riste utvalget for 20 min på medium hastighet (nivå 9) og sentrifuge det 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjerne nedbryting og innskudd celle pellet i samling rør som inneholder 10% NBF.
- Legge til 4 dråper en celle blokk forberedelse reagens (se Tabell of Materials) til celle pellets.
- Overføre celle pellets til en kassett, fikse det i 10% NBF, og parafin-bruk den for cellen blokk forberedelse og snitting (se trinnene 1.1-1.7).
3. PD-L1 flekker analysen
- Slå på autostainer og datamaskinen.
- Dobbeltklikk på ikonet autostainer og velg brukeren.
- Klikk på "Opprett label" og deretter på '-protokollen.
- Dobbeltklikk på 22C 3-protokollen.
Merk: Protokollen først er installert på den autostainer datamaskinen ved å klikke på "Opprett Protocol". Hele protokollen tilbys som supplerende fil 1. - Skrive pasientens ID på etiketten, og klikk på 'Print'.
- Stick etiketten på lysbildet.
- Åpne lysbildet skuffen ved å trykke på knappen av skuffen som er valgt.
- Plass merket lysbildet på varmeplate med etiketten vendt opp- og innover.
- Lukk lysbildet skuffen.
- Fjerne dekslene fra dispensere og laste reagensene på reagensene stativer.
- Åpne panseret på fargemaskin og plassere stativer på reagensene carrousel sørge for at de får plass og holde i posisjon.
- Lukke panseret.
- Programvaren, klikk på hvilket instrument som brukes, og klikk på 'Kjører'.
- På slutten av IHC prosedyren, skyll lysbildet i flere sekunder med vann og en dråpe et rengjøringsmiddel.
- Rehydrate lysbildet med en bad etanol 100% og en andre bad av etanol 95% i flere sekunder.
- Plass lysbildet inn i coverslipping maskinen for en automatisert lasting av dekkglassvæske.
4. tolkning av den PD-L1 flekker
Merk: En kvalifisert patologen utføre tolkningen av PD-L1 IHC testen.
- Vurdere kvaliteten på den PD-L1 flekker ved å analysere de positive og negative kontrollene før eksamen av pasientens.
Merk: Resultatene på pasientens prøven anses ugyldig hvis den flekker av kontrollene ikke er akseptabelt. - Bekrefte tilstedeværelse av minst 100 levedyktig svulst cellene under et mikroskop.
Merk: Rapport når pasientens prøven har mindre enn 100 kreftceller. - På en lav forstørrelse på 4 X, vurdere alle bevarte positive og negative svulsten områder.
Merk: På en lav forstørrelse, delvis membran flekker eller membran farging av svak intensitet (1 +) kan være vanskelig å gjenkjenne. - Score delvis eller fullstendig cellemembranen flekker.
Merk: I cytoplasma flekker har skal utelates fra tolkningen. - Beregne TPS ved å vurdere andelen av PD-L1 positiv kreftceller i forhold til alle kreftceller i den godt bevarte svulst områder.
Merk: Bare levedyktig kreftceller bør undersøkes. Alle andre Mobiltlf elementer, som immunceller, nekrotisk celler, normale celler og gjenstander, må bli ekskludert fra eksamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, og som er beskrevet i detalj i denne gruppen siste publikasjoner10,11, ble optimalisert LDTEN klinisk godkjent med 120 arkivering FFPE NSCLC biopsi prøver fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk resection eller en biopsi på Pasteur University Hospital, Nice, mellom mars 2007 og mars 2016. Videre for vurdering av PD-L1 uttrykk for cytologi eksempler, TPS ble evaluert i 70 sammenkoblede vev biopsi prøver og celleblokker som ble utarbeidet av bronkial vasker (n = 40) eller pleural effusions (n = 30) (samlet på Pasteur Universitetssykehuset, hyggelig, mellom juli 2014 og 2016 November). Alle lysbildene var fersk kuttet og farget innen 24 timer.
En representant flekker mønster med biopsi prøver med 22C 3 antistoff konsentrat (LDTEN), sammenlignet med PD-L1 IHC 22C 3 følgesvenn analysen (gull standard) er vist i figur 1A og 1B. Bruker en TPS ≥1%, 54/120 tilfeller (45%) ble PD-L1 positivt, mens en TPS ≥50%, 29/120 tilfeller (24%) ble vurdert positivt for PD-L1.
Intraclass korrelasjonskoeffisienten (ICC) brukes til å måle sammenhengen av TPS score som en kontinuerlig variabel var 99% mellom LDTEN og gull-standarden. Bruker både TPS kuttet ≥1% og ≥50%, κ score for interpathologist avtalen var lik 1 i LDTEN plattformen.
En representant flekker mønster med cytologi prøver med 22C 3 antistoffer konsentrere LDTEN sammenlignet med PD-L1 IHC 22C 3 kit (gull standard) er vist i figur 1 c og 1 D. Konkordans frekvensen av 70 biopsi og cytologi eksempler med LDTEN bruker én av TPS skjær rundt ≥1% og ≥50% var større enn 95%, og ICC bruke TPS score da en kontinuerlig variabel var mellom 0,88 og 0.90. Dette funnet var konsekvent over hver type cytologi eksempler (pleural effusjon vs. bronkial vask) eller svulst histology (adenocarcinoma vs. squamous celle carcinoma) med en ICC mellom 0,82 og 0.96. Når du sammenligner PD-L1 TPS på 37 (av 70) par cytologi eksempler med LDTEN til biopsi prøvene med gull standard, konkordans hastigheten ≥1% TPS eller ≥50% TPS kuttet punkt var større enn 97% og ICC var mellom 0.93 og 0.95.
Figur 1: representant flekker mønster på biopsi og cytologi prøver med 22C 3 antistoff konsentrat (LDT), sammenlignet med den PD-L1 IHC 22C 3 kit (gullstandarden). (A) dette panelet viser PD-L1 IHC 22C 3 analysen brukt på en svulst biopsi. (B) dette panelet viser optimalisert LDTEN bruker 22C 3 antistoff konsentrat på seriell inndelinger fra den samme svulst biopsy som analyseres i panelet A. (C) dette panelet viser PD-L1 IHC 22C 3 analysen i en celle blokk. (D) dette panelet viser optimalisert LDTEN bruker 22C 3 antistoffer konsentrere seg om føljetong deler fra samme celle blokk som analyseres i C-panelet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har validert en optimalisert LDT bruker 22C 3 PD-L1 antistoff konsentrat, ved å sammenligne den med den tilsvarende klinisk godkjent kommersielle test10,11. 22C 3 konsentrert antistoff-baserte LDT viste et høyt for overensstemmelse mellom biopsi (~ 100%) og cytologi (~ 95%) prøver i forhold til PD-L1 IHC uttrykket bestemmes ved hjelp av PD-L1 IHC 22C 3 analysen på både ≥1% TPS og ≥50% TPS kuttet poeng. Nylig anbefalt av International Association for studie av lungekreft, PD-L1 positiv områdene skal være det samme for ca 10 PD-L1 negative prøver, 10 PD-L1 positiv prøver og 20 prøver dekker lineær dynamiske område på klinisk godkjent teste PD-L1 IHC8. Vi utførte en validering studie på 120 biopsier og 70 cytologi eksempler. Samlet var konkordans høy, uavhengig av TPS cutoff positivitet, prøver, eller svulst histology. Resultatene presenteres her er med de andre tidligere studier som viser et høyt for concordance for både vev og cytologi prøver12,13,14,15.
I denne studien alle prøvene var faste i 10% NBF. Vi ikke evaluere virkningen av andre fiksativene, mens effekten på PD-L1 farging av andre ikke-formalin fiksativene som alkohol-basert fiksativene er for tiden uutforskede. Tilstedeværelsen av immunceller uttrykke PD-L1, spesielt makrofager, garanterer en forsiktig tolkning av cytologi prøver. Disse prøvene må evalueres med føljetong hematoxylin og eosin lysbilde, og i noen vanskelige tilfellene, utfyllende flekker å vurdere immunceller kan gjøres for å utelukke en feiltolkning av PD-L1 uttrykket i kreftceller bare.
Denne studien har flere begrensninger, inkludert retrospektiv på en eneste institusjon, og det faktum at ingen pasient ble behandlet med pembrolizumab å vurdere det kliniske utfallet. I tillegg presenteres en mindre begrensning av LDTEN her bekymringer detaljert flekker mønsteret som ble observert noen ganger når du bruker forsterkning systemer, som kan gjøre sin tolkning vanskeligere. Videre er flekker mønster av immunceller mer intens enn observert med gull standard. Opplæring av patologer er nødvendig for å oppnå en riktig tolkning av PD-L1 farging med IHC. 16
I klinisk setting må robust LDTs opprettholdes over tid ved å be om sertifisering og akkreditering av følgende standard operasjonsprosedyrer og ved å regelmessig delta i eksterne kvalitet vurdering ordninger8. Garanti for klinisk prediktiv ytelsen kan sikres bare når disse forutsetningene er dyktig8.
Protokollen presenteres her adresser kritiske behovet for PD-L1 LDTs på både biopsi og cytologi eksempler når analysert på en allment tilgjengelig autostainer over større geografiske områder som ikke kan være utstyrt med gullstandarden analysen. LDTEN presenteres her, som var optimalisert med 22C 3 antistoff konsentrat, kan brukes til å evaluere PD-L1 uttrykket i både biopsi og cytologi eksempler fra NSCLC pasienter. Dette vil betydelig utvide antallet laboratorier som kan tilby høy kvalitet PD-L1 testing for å identifisere pasienter med NSCLC som er kvalifisert for behandling med pembrolizumab monoterapi, på en pålitelig og reproduserbar måte.
En potensiell fremtidig retning er å evaluere muligheten for å bruke andre cytologi prøven typer (f.eksprøver fra fin-nål biopsier, bronkoskopi-guidede FNA, endobronchial ultralyd-guidet FNA og bronkial børster) med 22C 3 antistoff konsentrat-baserte LDTs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble sponset av Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Fond spilte ingen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
- Garon, E. B., et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
- Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis. Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).
- Padmanabhan, V., et al. Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).
- Tsao, M. S., et al. IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).
- Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective. Lung Cancer. , 102-105 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms. PLoS One. 12 (8), e0183023 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients. Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).
- Skov, B. G., Skov, T. Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).
- Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas. Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy. Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).
- Ilie, M., Hofman, P. Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them. Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).
