Summary
안정적이 고 재현 가능한 방식으로 pembrolizumab, 치료에 대 한 폐암 환자의 자격을 평가 하는 전세계 실험실의 기능을 확장 하려면 우리 22C 3 항 체 집중에는 널리 사용 하는 분석 결과 개발 생 검과 세포학 표본에 대 한 immunohistochemical autostainer
Abstract
Pembrolizumab monotherapy PD-L1-표현 고급 비 작은 세포 폐암 (NSCLC) 환자의 첫 번째 및 두 번째 라인 치료에 대 한 승인 되었습니다. PD L1 식 PD L1 immunohistochemistry (IHC) 22C 3 동행자 진단 분석 결과 함께 테스트 점수 (TPS), 종양 조직에 검증 된 종양 비율을 제공 하. 우리는 최적화 된 실험실 개발 테스트 (LDT) 생 검과 세포학 표본에 대 한 널리 IHC autostainer에 22C 3 항 체 (Ab) 집중을 사용 하는 개발. PD L1 TPS 120 쌍된 전체 종양 조직 단면도 및 생 검 견본 평가 되었다 고 70 쌍 생 검 및 세포학 샘플 (기관지 세척, n = 40; 흉 울트라 바이올렛 effusions, n = 30). 집중 기반 LDT 보여주 세포학 생 (~ 100%)와 높은 색인 속도 (~ 95%) 표본 두 TPS에서 PD L1 IHC 22C 3 동반자 분석 결과 사용 하 여 결정 하는 PD L1 IHC 식에 비해 22C 3 Ab 컷 포인트 (≥1%, 50%). 22C 3 Ab 집중을 사용 하 여 두 종양 조직 및 세포학 표본, PD L1 식을 결정 하려면 여기, 최적화 된 LDT NSCLC 환자의 치료에 대 한 자격을 평가 하기 위해 실험실 전세계의 능력을 확장 됩니다. pembrolizumab monotherapy 안정적이 고 재현 가능한 방식입니다.
Introduction
최근 임상 시험 pembrolizumab는 인간 답게 단일 클로 널 IgG4 카파 isotype 항 체 (PD-1) 프로그램 된 세포 죽음 1 사이의 상호 작용을 차단 하 고 그것의 ligands, PD L1 및 l 2 PD 환자의 치료에서의 효능 입증 고급 NSCLC1,2,,34.
현재, pembrolizumab 두 치료 순진한 환자 50 %와 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) 없거나 anaplastic 림프 종 키나 제 (ALK) 게놈 종양 착오3의 PD L1 식이 TPS에에서 PD L1 표현 NSCLC의 치료에 대 한 승인 이전에 대 한 ≥11의 PD L1 TPS와 환자 치료.
PD L1 단백질 표정 IHC에서 검색 널리 예측 바이오 마커 분석 결과로 안티-PD-1/PD-L1 요법를 사용 했다. Pembrolizumab 임상 시험에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 샘플으로 얻은 PD L1 TPS PD L1 IHC 22C 3 동반자 분석 결과5를 사용 하 여 결정 되었다. 이 분석 결과 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 승인 되었습니다 하 고 종양 PD L1 TPS5의 결정에 대 한 유럽에서 CE 표시 되었습니다.
22C 3 항 체 집중 사용 LDTs와 PD L1 TPS의 안정적이 고 높은 품질 평가 기관에서 추가 글로벌 옵션 pembrolizumab에 대 한 환자 자격에 관한 임상 결정을 지원 하기 위해 필수적입니다. 치료입니다. 병 리 실험실의 많은 동행자 진단 PD L1 IHC 22C 3 분석 결과에 대 한 액세스를 필요가 없습니다. 따라서, 안정적이 고 일관 된 LDTs 호환, 널리 IHC autostainer 플랫폼의 개발은 필수적입니다.
또한, LDTs NSCLC 환자에서 자주 사용할 수 있는 유일한 견본 유형 세포학 샘플을 사용 하 여 설정할 필요가 있다. PD L1 IHC 22C 3 동반자 분석 결과 상계 100 종양 세포를 생성 하는 경우에 절제, 중 핵 바늘 생 검, 그리고 bronchoscopies에 대 한 유효성이 검사 됩니다. 위의 샘플 종류 자주 얻을 수 있습니다, 비록 세포학 샘플은 보다 쉽게 수집 되며 일부 기관6,7에 가장 일반적으로 사용 가능한 샘플 종류. 그러나, 현재는 아무 검증된 진단 분석 결과 세포학 샘플;에 PD L1 식의 평가에 사용할 수 있는 안정적인 LDTs 세포학 샘플와 호환 것 이다 더 높은-품질 PD L1 테스트 용이 하 게.
또한,는 LDT의 임상 유효성 검사를 설정 하는 경우는 IHC 해당 임상 검증 된 상용 테스트8에 유사한 방법으로 수행 되어야 한다. 예를 들어, 몇 가지 중요 한 단계는 항 체 적정, 전처리 지연, 보육 시간, 증폭 시스템9등 직렬 섹션에 동일한 신호를 확인 되어야 한다.
우리는 최근 22C 3 항 체 집중 종양 생 검 및 세포학 샘플10,11PD L1 식을 사용 하 여 최적화 된 LDT를 개발 했다. 우리는 LDT 대 "금 표준" PD L1 IHC 22C 3 분석 결과10,11와 높은 일치 발견. 이 임상 검증된 프로토콜 신뢰할 수 있는, 높은-품질 PD L1 세계적으로 지역 전역에 걸쳐 테스트를 지원 합니다.
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Protocol
모든 절차 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 (인간 연구 윤리 위원회, 센터 Hospitalier 대학 드 니스/Tumorothèque BB-0033-00025).
참고:이 프로토콜은 특별히 조정 (autostainer 여기,로 테이블의 자료를 참조 함) 상용 자동된 IHC 염색기에 22C 3 항 체 집중의 사용에 대 한 종양 생 검 및 세포학 샘플.
1입니다. 종양 조직 샘플의 준비
- 종양 조직 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF)는 카세트에 수정 했다.
참고: 인접 폐 종양에서 종양 조직은 상계, 온건한 진정에서 pulmonologist, 또는 폐 전문가 의해 수행에 의해 일반적으로 얻어진 다. 주변 병 변 및 확산 폐 질환에 대 한 transbronchial 또는 바늘 생 검 표시 됩니다. 이 절차는 일반적으로 수술 실 또는 집중 치료 단위에서 수행 됩니다. - 파라핀에 카세트를 포함 합니다.
참고: 고정 관류 또는 바로 다음 해 부, 침수에 의해 달성 될 수 있다 하며 일반적으로 8-10 h. 통 볼륨 15-20 x 견본 볼륨 보다 높은 해야 합니다. 그것은 overfixation 항에의 하면 때문에 10 h 이상에 대 한 생 검 조직을 해결 하기 위해 권장 하지 않습니다. 고정 속도 실 온에서 약 1 m m/h. - 조직 프로세서에 왁 스로 고정된 조직 샘플을 침투 ( 재료의 표참조).
참고: 탈수는 70%, 85%, 그리고 90% 농도 증가 함께 3 알코올 목욕에서 수행 됩니다. 물 3 마지막 절대 알코올 목욕에 의해 마지막으로 제거 됩니다. 청소는 3 톨루엔 목욕 그리고 뜨거운 왁 스 탕 (44-60 ° C)에 왁 스 침투에서 수행 됩니다. - 녹은 파라핀으로 가득 금형 내부 조직 포함 ( 재료의 표참조) 응고를 기다립니다.
- 톰에 3 μ m의 두께에 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도.
- 이동 충전 된 현미경 유리 파라핀 리본 슬라이드 ( 재료의 표참조).
- 건조 1 h 37 ° c.에 대 한 슬라이드
참고: 조직 섹션 2-8 ° C (선호)에서 또는 실내 온도에 저장 antigenicity, 보존 하 고 단면 15 d 내 얼룩에 25 ° C까지.
2입니다. 세포학 샘플의 준비
-
방부 제 솔루션에서 기관지 빨 래를 수집 (재료의 표 참조).
참고:이 위해 표준 상계 기술이 사용 됩니다.- 게 수 샘플링을 기관지의 분포. 깨끗 한 용기에 세척을 수집 합니다. 레이블 환자와 컨테이너의 첫 번째 그리고 마지막 이름, 생년월일, 및 견본 원본.
- 50 mL 원뿔 튜브를 기관지 빨 래를 전송 하 고 DL Dithiothreitol의 2 세대 추가 30 분, 관 동 ( 재료의 표참조), 분말 및 다음 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심.
- 상쾌한을 제거 하 고 mucolytic 솔루션의 10 mL을 추가 ( 재료의 표참조).
- 중간 속도 (레벨 9)에서 20 분에 대 한 샘플을 동요 하 고 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심.
- 상쾌한을 제거 하 고 10%를 포함 하는 컬렉션 튜브에 셀 펠 릿 입금 NBF.
- 셀 블록 준비 시 약 4 방울을 추가 ( 재료의 표참조) 셀 펠 릿을.
- 카세트에 셀 펠 릿, 10%에서 그것을 수정 NBF, 및 파라핀-포함할 셀 블록 준비 및 단면 (1.1-1.7 단계 참조).
3. PD L1 얼룩 분석 결과
- autostainer와 컴퓨터에 전환 합니다.
- Autostainer 아이콘을 두 번 클릭 합니다 하 고 사용자를 선택 합니다.
- '만들기 레이블' 에 그리고 '프로토콜 '을 클릭 합니다.
- 22C 3 프로토콜 두 번 클릭.
참고: 프로토콜은 처음 설치 autostainer의 컴퓨터에 ' 프로토콜 만들기 '를 클릭 하 여. 전체 프로토콜 보충 파일 1로 제공 됩니다. - 라벨에 환자의 ID를 작성 하 고 '인쇄'클릭.
- 슬라이드에 라벨을 스틱.
- 선택한 윈도우의 버튼을 눌러 슬라이드 서랍을 엽니다.
- 레이블이 지정 된 슬라이드 업 및 내부를 직면 하 고 라벨 열 패드에 넣습니다.
- 슬라이드 서랍을 닫습니다.
- 디스펜서에서 뚜껑을 제거 하 고 로드 시 약 시 약의 선반에.
- 염색기의 후드를 열고 시 약 회전 목마 만드는 그들이 맞는 위치에 있는지에 선반을 배치.
- 후드를 닫습니다.
- 소프트웨어 악기를 사용 하 고 '실행'을 클릭에 클릭 합니다.
- IHC 프로시저의 끝에, 수도 물과 청소 솔루션의 한 방울 몇 초 동안 슬라이드를 씻어.
- 몇 초 동안 에탄올 100%의 한 목욕 및 에탄올 95%의 두 번째 목욕 슬라이드를 rehydrate.
- 장소는 coverslip의 자동된 로딩을 위한 coverslipping 기계에 슬라이드.
4. PD L1 얼룩의 해석
참고: 정규화 된 병리학 자 PD L1 IHC 시험의 해석을 수행 해야 합니다.
- 환자의 표본 검사 전에 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 분석 하 여 PD L1 얼룩의 품질을 평가 합니다.
참고: 환자의 표본에서 얻은 결과 컨트롤의 얼룩이 지는 것은 용납할 수 없는 경우 잘못 된 간주 됩니다. - 최소 100 가능한 종양 세포는 현미경의 존재를 확인 합니다.
참고: 보고서 때 환자의 표본은 100 미만 종양 세포. - 4 X의 낮은 확대, 모든 잘 보존 된 긍정적인 및 부정적인 종양 분야를 평가 합니다.
참고: 낮은 확대율에서 부분 막 얼룩 또는 약한 강도 (1 +) 막 얼룩 어려울 수 있습니다 인식 하. - 부분적 또는 완전 한 세포 막 얼룩 점수.
참고: 세포질 얼룩 해석에서 제외 될 수 있다. - 모든 종양 세포 종양이 잘 보존 된 지역에 상대적으로 PD L1 긍정적인 종양 세포의 비율을 평가 하 여 TPS를 계산 합니다.
참고: 가능한 종양 세포만 시험 되어야 한다. 모든 다른 세포 등의 요소, 면역 세포, 회 저 성 세포, 정상 세포, 및 유물, 검사에서 제외 해야 합니다.
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Representative Results
여기, 그리고 세부 사항에 설명 된 대로이 그룹의 최근 간행물10,11에서 제시 하는 절차를 사용 하 여 최적화 된 LDT 외과 수술 환자에서 120 보관 FFPE NSCLC 생 샘플 임상 검증 되었다 파스퇴르 대학 병원에서 생 검 또는 절제 니스, 2007 년 3 월 및 3 월 2016 사이. 또한, 세포학 샘플의 PD L1 식의 평가 위한 TPS 70 쌍된 조직 생 검 견본 및 기관지 세척에서 준비 된 셀 블록에 평가 되었다 (n = 40) 또는 흉 막 울트라 바이올렛 effusions (n = 30) (수집는 파스퇴르에서 대학 병원, 7 월 2014와 11 월 2016 사이 좋은). 모든 슬라이드 갓 잘라 고 24 시간 이내 스테인드.
생 검 표본 22C 3 항 체 집중 (LDT) PD L1 IHC 22C 3 동반자 분석 결과 (금 본 위 제)와 비교를 사용 하 여 그림 1A 및 1B에 표시 된 패턴을 얼룩이 지는 대표적인. ≥1 %의 TPS를 사용 하 여, 54/120 경우 (45%)은 PD L1 긍정적인, 50 %의 TPS를 사용 하는 동안 29/120 경우 (24%) 고려 되었다 긍정적인 PD L1에 대 한.
Intraclass 상관 계수 (ICC)를 연속 변수로 TPS 점수의 상관 관계를 측정 하는 데 사용 되는 LDT와 금 사이 99% 이었다. ≥1 %와 50 %의 포인트를 잘라 두는 TPS를 사용 하 여, interpathologist 계약에 대 한 κ 점수 LDT 플랫폼 1.
세포학 PD L1 IHC 22C 3 키트 (골드 표준)에 비해 LDT 집중 표본 22C 3 항 체를 사용 하 여 패턴을 얼룩이 지기 대표 그림 1C 및 1d에 표시 됩니다. TPS의 중 하나를 사용 하 여 테스트 통과 함께 생 검 및 세포학 샘플의 70 쌍의 일치 율 ≥1 %의 포인트를 잘라내어 50 %95%, 및 연속 변수 0.88와 0.90으로 TPS 점수를 사용 하 여 ICC 보다 컸다. 이 찾는 세포학 샘플의 각 유형에 걸쳐 일관 되었다 (흉 막 유출 vs. 기관지 세척) 또는 종양 조직학 (선 암 대. 편평 상피 세포 암) 0.82 0.96 사이의 ICC와. (70)에서 37의 PD L1 TPS를 비교할 때 골드 표준, TPS ≥1% 또는 50% 포인트 인하 하는 TPS 사용 하 여 색인 속도와 생 검 견본에 LDT와 세포학 샘플의 쌍 보다 큰 97% 이었고 ICC 0.93과 0.95 사이 했다.
그림 1: PD L1 IHC 22C 3 키트 (골드 표준)에 비해 생 검과 세포학 표본 22C 3 항 체 집중 (LDT)을 사용 하 여 패턴을 얼룩이 지기 대표. (A)이이 패널 표시 PD L1 IHC 22C 3 분석 결과 종양 생 검에 사용 합니다. (B)이이 패널 패널 A에서 분석 같은 종양 생 검에서 직렬 섹션에 22C 3 항 체 집중을 사용 하 여 최적화 된 LDT를 보여줍니다. (C)이이 패널 셀 블록에 PD L1 IHC 22C 3 분석 결과를 보여 줍니다. (D)이이 패널 패널 C분석 최적화 LDT 22C 3 항 체를 사용 하 여 같은 셀 블록에서 직렬 섹션에 집중을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리 22C 3 PD L1 항 체 집중을 사용 하 여 해당 임상 검증 된 상용 테스트10,11에 그것을 비교 하 여 최적화 된 LDT를 확인 했습니다. 22C 3 집중 항 체 기반 LDT 생 (~ 100%)과 세포학 (~ 95%) 표본 ≥1 %TPS 50% 포인트 인하 하는 TPS에서 PD L1 IHC 22C 3 분석 결과 사용 하 여 결정 하는 PD L1 IHC 식에 비해 사이 높은 일치 율을 보였다. 최근 폐암의 연구에 대 한 국제 협회에 의해 권장로 PD L1 긍정적인 영역 같아야 약 10 PD L1 부정적인 샘플, 10 PD L1 긍정적인 예제, 및 20 샘플의 선형 동적 범위는 임상 검증 PD L1 IHC8을 테스트 합니다. 우리는 120 biopsies을 70 세포학 샘플에 유효성 검사 연구 수행. 전반적으로, 일치는 양성, 표본, 또는 종양 조직학 유형의 컷오프 TPS 별도로 높은 했다. 여기에 제시 된 연구 결과와 그 조직 및 세포학 표본12,,1314,에 대 한 높은 일치 율을 보여주는 다른 이전 연구는15.
이 연구에서는 모든 표본 10% 고정 했다 NBF. 우리와 같은 알콜 기반 fixatives은 현재 탐험 PD L1 다른 비 말린 fixatives의 얼룩에 영향 하는 동안 다른 fixatives의 영향을 평가 하지 않았다. PD-L1, 특히 대 식 세포를 표현 하는 면역 세포의 존재 보증 세포학 표본의 주의 해석 합니다. 이러한 샘플 직렬 hematoxylin 및 오신 슬라이드에 관하여 평가 한다 하 고, 어려운 경우에 면역 세포를 평가 하기 위해 보완 얼룩 종양 세포만에 PD L1 식의 어떤 오해를 제외 하려면 수행할 수 있습니다.
이 연구는 한계, 단일 기관, 그리고 아무 환자 임상 결과 평가 하는 pembrolizumab로 대우 되었다는 사실에서 회고전 분석을 포함 한 수를 보유 하고있다. 또한,는 LDT의 사소한 제한 제시 여기 우려 세부적인 얼룩 패턴을 그들의 해석을 더 어렵게 만들 수 있습니다 증폭 시스템을 사용 하는 경우에 때때로 관찰 되었다. 또한, 면역 세포의 얼룩 패턴 골드 표준 관찰 보다 더 강렬 하다. 병리학의 훈련은 PD L1 IHC와 얼룩의 정확한 해석의 얻을 필요가 있다. 16
임상 설정에서 LDTs의 견고성은 인증 및 인가 추구 하 여, 다음 표준 운영 절차, 및 외부 품질 평가 제도8에 정기적으로 참여 하 여 시간이 지남에 따라 유지 될 필요가 있다. 경우에 이러한 필수 구성이 요소 달성된8임상 예측 성능 보장을 보장 수 있습니다.
프로토콜 제시 여기 주소 표준 분석 결과 갖춘 되지 않을 수 있습니다 지리적 영역에 걸쳐 광범위 하 게 사용할 수 있는 autostainer에 분석 될 때 생 검 및 세포학 샘플에 PD L1 LDTs에 대 한 중요 한 필요. 22C 3 항 체 집중을 사용 하 여 최적화 되었다는 여기, LDT NSCLC 환자에서 생 검 및 세포학 샘플에 PD L1 식 평가를 사용할 수 있습니다. 이 크게 실험실 높은-품질 PD L1 NSCLC 환자 식별 하 테스트를 제공할 수 있는 안정적이 고 재현 가능한 방식으로 pembrolizumab monotherapy 치료 받을 수 있는의 수를 확장 합니다.
잠재적인 미래 방향을 다른 세포학 견본 종류를 사용 하 여의 타당성을 평가 하는 것입니다 (예를 들어를 정밀한 바늘 생 검, 상계 기반 FNA endobronchial에서 표본 초음파-유도 FNA, 그리고 기관지 브러쉬) 22C 3 항 체와 집중-기반 LDTs입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 머 크 & 주식, Inc., 케 닐 워스, 뉴저지, 미국에 의해 후 원했다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 아무런 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
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