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Cancer Research

Potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe cómo evaluar sinergismo entre un anticuerpo contra el cáncer y fármacos antineoplásicos en modelos preclínicos mediante la ecuación de índice de combinación de Chou y Talalay.

Abstract

Potenciación de la hostiles anticuerpos monoclonales (mAb) por agentes quimioterapéuticos constituye una estrategia valiosa para el diseño de una terapia eficaz y segura contra el cáncer. Aquí proporcionamos un protocolo para identificar una combinación racional en la etapa preclínica. En primer lugar, se describe un ensayo basado en células para evaluar el sinergismo entre mAb contra el cáncer y las drogas citotóxicas, que utiliza la ecuación de índice de combinación de Chou y Talalay1. Esto incluye la medición del tumor celular drogas y anticuerpos-sensibilidad usando un análisis MTT, seguido de un análisis automatizado de la computadora para calcular los valores de índice (CI) de combinación. Valores de CI de < 1 indican sinergismo entre mAbs probado y agentes citotóxicos1. Para corroborar la en vitro resultados en vivo, además se describe un método para evaluar la eficacia del régimen de combinación en un modelo de xenoinjerto tumoral. En este modelo, el régimen combinado retrasa significativamente el crecimiento del tumor, que se traduce en una significativa supervivencia extendida en comparación con controles de agente único. Lo importante es la experimentación en vivo revela que el régimen de combinación es bien tolerado. Este protocolo permite la evaluación eficaz de combinaciones de fármacos contra el cáncer en modelos preclínicos y la identificación de una combinación racional para evaluar en ensayos clínicos.

Introduction

El enfoque convencional en el tratamiento de un gran número de diferentes tipos de cáncer se basaba en monoterapia. Aunque todavía se utiliza en muchos casos, este método reunieron varios obstáculos lleva a optar por terapias combinadas2. Particularmente, las células cancerosas son más susceptibles a desarrollar resistencia cuando se tratan con un solo medicamento por inducir supervivencia alternativos mecanismos3, resultando en fracaso terapéutico de pacientes4. Por otra parte, en monoterapia, medicamentos generalmente son administrados en una dosis alta. Esta situación a menudo resulta en la ocurrencia de fuertes efectos secundarios de dosis dependiente que puede ser intolerable y obligar a los médicos para detener el tratamiento2. Por estas razones, la Asociación de moléculas contra el cáncer ahora es preferido a la monoterapia.

Combinaciones de medicamentos ideal serían las que actúan en sinergia contra células tumorales, sin aumento de la toxicidad contra las células normales. Sinergia se refiere a la interacción de dos o más medicamentos que produce un efecto terapéutico mayor que la suma de cada droga individual actuando por separado. Estas interacciones pueden resultar en mayor eficacia terapéutica clínica2. Límites de la resistencia al tratamiento, aumenta la eficacia y también puede reducir la toxicidad2. De hecho, puede reducirse la dosis de cada medicamento para disminuir sus efectos secundarios apuntando a distintas vías. Además, una de las moléculas también puede servir como un agente de sensibilización contra las células cancerosas. El efecto de la segunda droga puede mejorarse en las células sensibilizadas y menos de la dosis puede ser utilizado5.

La terapia combinada puede incluir dos o más medicamentos quimioterapéuticos o biológicos, como anticuerpos monoclonales6. Estos mAbs apuntar específicamente las células que expresaban un antígeno de superficie de la célula de interés y son capaces de matar células tumorales a través de vías inmunológicas incluyendo la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), con la participación de las células efectoras inmunes 7y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)6. También puede actuar a través de un mecanismo no inmunológico mediado por apoptosis8,9,10,11. En este caso, la inducción del proceso de muerte celular programada puede sensibilizar las células de cáncer, debilitan su función y hacer el fármaco quimioterápico asociado más eficaz en una dosis más baja. Como tal, proapoptotic mAb son buenos candidatos para el diseño de regímenes de combinación con fármacos antineoplásicos.

Se han descrito diferentes modelos matemáticos para evaluar sinergismo de drogas; uno de ellos se basa en la combinación del método de índice1. Este método se basa en el principio de efecto mediano desarrollado por Chou1. La ecuación de la mediana-efecto correlaciona la dosis de droga y el efecto de la droga como sigue.

Equation 1

Aquí, D es la dosis de la droga; DM es la dosis mediana-efecto; FA es la fracción afectada por la dosis; m es un exponente que indica la forma de la dosis-efecto parcela1. La dosis mediana de efecto se utiliza para calcular la dosis de Dx de un fármaco que inhibe o mata a "x" por ciento de las células. Luego se calcula el valor de CI para evaluar el efecto aditivo de la combinación de drogas, de la siguiente manera1.

Equation 2

CI el valor de 1 indica un efecto aditivo y un valor de CI de < 1 indica un efecto sinérgico, mientras que un valor de CI de > 1 indica antagonismo1. La aplicación de este método se facilita aún más la disponibilidad de un programa de computadora, CompuSyn, que determina el sinergismo y el antagonismo en las dosis o los niveles de efecto simularon automáticamente12.

Nuestro grupo ha desarrollado el mAb 8B6 específico del antígeno O-acetil-GD2 para neuroblastoma gangliósido (OAcGD2)13 y otros demostraron que esta mAb es capaz de inducir la muerte celular con atributos de apoptosis11. Para probar si mAb 8B6 puede sensibilizar las células del neuroblastoma en el topotecán agente antineoplásico, adaptamos el método antedicho, desarrollado por Chou1. En primer lugar, determinamos los dosis efectiva 50 (ED50) los valores de mAb 8B6 y topotecán. A continuación, las células de neuroblastoma con equipotente relaciones de los dos compuestos basados en ED50 valores están expuestas para determinar los valores de CI con el software de simulación antes mencionados. Este método nos permite demostrar sinergismo entre mAb 8B6 y topotecan in vitro. A continuación, se describe un protocolo para evaluar aún más la potencia y la seguridad de esta combinación régimen en vivo. Este protocolo se puede aplicar fácilmente para seleccionar combinaciones de agente quimioterapéutico y mAb anticáncer potente y seguro en estudios preclínicos. Una representación esquemática de este estudio se proporciona en la figura 1.

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Protocol

Alojamiento de los animales y procedimiento experimental fueron aprobados por el gobierno francés (acuerdos #C44-278 y #APAFIS 03479.01). Procedimientos y cuidado de los animales se realizaron bajo Directiva UE 2010/63/UE y ley #2013-118 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.

1. evaluación de la interacción entre el medicamento mAb 8B6 y Topotecan In Vitro

  1. preparación de la muestra de 96 pocillos
    PRECAUCIÓN: Consulte con la Comisión de salud y seguridad de la institución y reglas de regulación local relacionados con la seguridad en el laboratorio. Revise la información Material y ficha de seguridad antes de trabajar con los medios de comunicación, líneas celulares o reactivos. Utilizar técnica estéril adecuada y trabajar en campana de flujo laminar. Todas soluciones/equipos que se utilizan para manipular las células deben ser estériles.
    Nota: El siguiente protocolo fue diseñado para uso con las células adherentes. Modificaciones están obligadas a aplicar el método a nonadherent células en suspensión; Este protocolo utiliza cuadruplicado para cada condición experimental.
    1. Crecen las células IMR5 en un matraz T75.
    2. En el primer día (día 0), observar el cultivo de células bajo un microscopio para verificar la confluencia celular. Aspire el medio celular del frasco, lavar con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añadir 3 mL de 0.05% ácido etilendiaminotetracético (EDTA) / solución de PBS. Vuelva el matraz a la incubadora por 3 min (37 ° C, 5% CO2).
    3. Examinar la cultura de célula bajo el microscopio para la separación de la célula.
      Nota: Si es necesario, retomar la cubeta de la incubadora durante un min de 3 a 5 adicional, dependiendo del tipo de tumor de la célula.
    4. Añadir 10 mL de medio completo celular al matraz y transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. Contar las células usando un hemocitómetro.
    5. Retire y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en el medio de cultivo completo. Ajustar el volumen del medio para obtener una concentración final de 1 x 105 células/mL.
    6. Pozos de una placa de cultivo de 96 pocillos con 104 células cada uno, que es 100 μl de suspensión celular de semillas 84. Seguir el diseño experimental que se muestra en la figura 2.
    7. Incube las células durante 18 horas en la incubadora de la célula (37 ° C, 5% CO2).
  2. Preparación de la solución de droga
    Nota: Para los estudios de sensibilización de drogas/mAb, modificar el tiempo, la longitud y el tratamiento de la concentración a la droga/mAb particular en cuestión. Tenga en cuenta que la concentración inicial es 3 x la concentración final.
    1. A la mañana siguiente (día 1), preparar las siguientes soluciones de drogas utilizando medio de cultivo completo.
      1. preparación de solución de mAb
        1. Diluir el mAb en 500 μl de medio de cultivo completo para obtener una solución de trabajo de anticuerpos con una concentración de mAb de 240 μg/mL.
        2. Realizar cinco diluciones dobles en serie como se indica en la figura 2.
      2. Preparación de solución de topotecán
        1. Diluido, como arriba, la droga en 500 μl de medio de cultivo completo para obtener una solución de trabajo de medicamentos con una concentración final de 120 nM.
        2. Realizar cinco diluciones dobles en serie como se indica en la figura 2.
      3. Preparación de solución de anticuerpo y medicamento
        1. Diluir las soluciones de drogas y mAb en 500 μl de medio de cultivo completo para obtener una solución de 120 drogas de nM y mAb de 240 μg/mL (solución de trabajo).
        2. Realizar cinco diluciones dobles en serie como se indica en la figura 2.
    2. Para llegar a la concentración final, transferir 50 μl de cada solución de la droga en los pocillos correspondientes, como se indica en el diseño experimental ( figura 2).
      Nota: Transferir 50 μl del medio de cultivo completo en los pocillos de untreated de la célula, como se indica en la figura 2.
    3. Incube las células durante 72 h en la incubadora (37 ° C, 5% CO2).
  3. Ensayo MTT
    1. Añadir 10 μl de solución de reactivo MTT en cada pozo.
    2. Incubar a 37 ° C por 4 h.
    3. Añada 100 μl de solución de lisis (10% SDS en 0.01 M HCl) en cada pocillo, utilizando una pipeta multicanal y homogeneizar mediante pipeteo.
    4. Incubar a 37 ° C por 4 h en una cámara humidificada (95% de humedad).
    5. Leer la absorbancia a 570 nm (un570) y 620 nm (un620) utilizando un espectrofotómetro.
      Nota: Mezcle cada muestra otra vez transfiriendo antes de leer la absorbancia; absorbancia a 620 nm permite la corrección de los valores de fondo no específicas.
    6. Calcular la absorbancia corregida: corregida absorbancia = un570- A620.
    7. Calcular la viabilidad celular como sigue: viabilidad celular = 100 x (promedio de absorbancia corregida de la muestra / absorbancia media corregida de control).
    8. Calcular los valores afectados por la fracción (Fa) mediante la siguiente ecuación: 1 - (absorbancia media corregida de la muestra / absorbancia media corregida de control).
  4. Software de simulación análisis de interacción de drogas individual y estudios de la combinación de medicamentos
    1. Ejecute el software de simulación para abrir la ventana de inicio.
    2. Haga clic en el botón Nuevo experimento para abrir la ventana principal .
    3. Escriba el nombre del experimento en la ventana de nombre .
      Nota: Puede añadirse una fecha en la ventana de fecha .
    4. Haga clic en el botón Nueva droga sola .
    5. Escriba el nombre en la ventana de Nombre completo .
    6. Escriba la abreviatura en la ventana de la abreviatura .
    7. Escriba la unidad de concentración de droga en la ventana unidades .
    8. Introduzca Datos punto 1 dosis y el valor de Fa, presione entrar.
    9. Repita este paso hasta que todos los puntos de datos se introducen.
    10. Haga clic en el botón terminado .
    11. Siga los mismos pasos para introducir puntos de datos de mAb.
      Nota: Utilice la misma unidad de concentración utilizada por droga.
    12. Haga clic en el botón de Nuevo una combinación de medicamentos .
    13. Seleccione medicamentos y mAb.
    14. Seleccione la Constante relación y haga clic en Aceptar.
    15. Escriba el nombre en la ventana de Nombre completo .
    16. Escriba la abreviatura en la ventana de la abreviatura .
    17. Escriba la relación droga/mAb en la ventana de relación .
    18. Introduzca Datos punto 1 dosis y presiona Enter.
      Nota: El programa calculará automáticamente las dosis de mAb y Combo.
    19. Introduzca el valor de Datos punto 1 Fa y presiona Enter.
    20. Repita este paso hasta que todos los puntos de datos se introducen.
    21. Haga clic en el botón terminado y, a continuación, haga clic en el botón Generar informe .
    22. Seleccione medicamentos y mAb y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    23. Seleccione el Combo y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    24. Seleccione encabezado, tabla de CIy cuadro resumen. A continuación, haga clic en Aceptar.
    25. Escriba el nombre de archivo del archivo de análisis y haga clic en Guardar para generar el informe.
      Nota: Después de hacer clic en Aceptar, el informe se abrirá automáticamente en el explorador de web predeterminado de la computadora.
    26. Para imprimir el informe, elija Imprimir del menú de archivo del navegador web. El informe contiene una sección de la tabla resumen que incluye título, fecha, nombre del archivo, Descripción Nota, parámetros (m, Dm y r), ED50 para cualquier agente utilizado en monoterapia o en combinación y la tabla de CI para cada combinación en ED50, ED 75, ED90y ED95.
      Nota: Un CI valor de < 1 indica sinergismo, CI valor = 1 indica la aditividad y un valor de CI de > 1 indica que el antagonismo.

2. generación de xenoinjertos de Neuroblastoma humano en ratones de Scid Gamma Nonobese NOD diabética (NSG ratones)

Nota: Excluye cualquier contaminación de la cultura de célula. Puesto que la matriz de la membrana del sótano forma un gel por encima de 5 ° C, todos los cultureware o los medios de comunicación entre en contacto con el reactivo de la matriz de la membrana del sótano deben ser prechilled/ice-cold. Mantener la matriz de la membrana del sótano en el hielo durante todo el proceso.

  1. Preparación de la suspensión de células de IMR5
    1. Descongelar el reactivo de la matriz de la membrana del sótano una noche sumergiendo el frasco en el hielo en un refrigerador de 4 ° C antes de usar.
    2. En el día 0, cosecha las IMR5 células cultivadas como se detalla arriba.
    3. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
    4. Deseche el sobrenadante. Lavar las células 2 x con 15 mL de PBS helado y preparar una suspensión de 5 x 107 células/mL en PBS helado.
      Nota: Si es necesario, transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    5. Agitar el frasco de la matriz de la membrana del sótano.
      Nota: El reactivo de la matriz de la membrana del sótano debe ser descongelado y dispersos.
    6. Añadir un volumen de reactivo de la matriz de la membrana del sótano y mezclar mediante pipeteo para obtener una suspensión de 2.5 x 107 células /mL.
    7. Mantener la suspensión de células en el hielo.
  2. Preparación de los ratones
    Nota: Los ratones deben ser de seis a siete semanas de edad.
    1. Mantener los ratones bajo la condición de libre de patógenos específica.
    2. Permitir un período de aclimatación de tres a cinco días después de han llegado los ratones.
    3. En el día de la inoculación, afeitarse el flanco donde la inyección será (ver paso 2.3.6).
  3. Preparación de la inyección de células de tumor
    Nota: Mantenga la suspensión de células de matriz de la membrana del sótano helado aséptica durante el procedimiento.
    1. Mezcle las células y extraer cuidadosamente la suspensión de células en una jeringa de 1 mL con una aguja de 21 G.
    2. Verifique para asegurarse que no hay ninguna burbuja de aire en la jeringa.
    3. Desinfectar la zona de inoculación del ratón con una solución antiséptica.
    4. Apriete suavemente la piel del ratón en el flanco entre los dedos, en el sitio de inyección.
    5. Inserte la aguja exactamente en el pliegue de la piel. No coloque la aguja en el tejido para asegurar una inyección subcutánea.
    6. Inyectar 100 μl de suspensión de células de IMR5 (es decir, 2.5 x 106 células) por vía subcutánea en el flanco derecho más bajo de los ratones.
    7. Rotar la jeringa para evitar la fuga y retirar la aguja.
  4. Monitoreo de cambios de peso y crecimiento del tumor
    1. Medir la longitud (A) y el ancho (B) del tumor con una pinza.
    2. Calcular el volumen del tumor mediante la fórmula (A x B2) x 0.5.
    3. Iniciar el tratamiento cuando los tumores han alcanzado un volumen promedio de ~ 50-60 mm3.

3. drogas y la administración de anticuerpos en ratones

  1. Administración intravenosa de mAb 8B6
    1. Cuidadosamente llene una jeringa de 1 mL con una aguja de 25 G con solución de mAb.
    2. Coloque el ratón bajo una lámpara de calor durante 10 minutos dilatar la vena de la cola.
    3. Refrenar el ratón en un limitador de roedor.
    4. Desinfectar la zona de inoculación del ratón con una solución antiséptica.
    5. Inserte la aguja paralela a la vena de la cola, penetrante 2-4 mm en la luz, manteniendo el bisel de la cara de la aguja hacia arriba (Figura 3A).
    6. Inyectar 100 μl de solución de anticuerpos por vía intravenosa (i.v.).
    7. Una vez terminada la inyección, presionar suavemente el sitio de la inyección para prevenir el sangrado.
  2. Administración intraperitoneal de topotecán
    1. Extraer la solución de la droga en una jeringa de 1 mL con una aguja de 25 G.
    2. Mantenga el ratón en una posición supina, con su extremo posterior levemente elevada.
    3. Desinfectar la zona de inoculación del ratón con una solución antiséptica.
    4. Busque la línea media del abdomen del ratón y mentalmente divida el abdomen en cuadrantes. Localizar el sitio de inyección en el cuadrante inferior derecho o izquierdo (figura 3B).
    5. Inserte la aguja en el abdomen (5 mm de profundidad) en ángulo de ~ 10°, en el cuadrante inferior derecho o izquierdo.
    6. Inyectar 100 μl de solución de droga por vía intraperitoneal (i.p.).
    7. Desinfectar el sitio de inoculación.

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Representative Results

Los resultados representativos y las figuras se adaptan con el permiso de trabajo anteriormente publicado14.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 aumenta sinérgicamente los efectos inhibitorios de topotecán en crecimiento de línea de células de Neuroblastoma:

Establecer el fármaco y las concentraciones de anticuerpo que se utilizará para la evaluación de sinergismo entre 8B6 topotecán y mAb, la droga y las sensibilidades de anticuerpos de IMR5 humana las células del neuroblastoma se midieron en primer lugar, mediante un ensayo MTT. Exposición a mAb 8B6 o topotecán solo durante 72 h dio lugar a una inhibición dependiente de la concentración de la viabilidad celular de IMR5 (Figura 4A). Curvas de dosis-respuesta permitieron el cálculo del ED50 valores para cada compuesto. Para ello, se calcularon valores de Fa usando el software de simulación de análisis. Los valores calculados de50 ED fueron encontrados para ser de 10 nM ± 1 de topotecán (Figura 4B) y 18 μg/mL ± 3 para mAb 8B6 (datos no mostrados).

Basado en estos valores de ED50 , luego, la potencia de seis equipotente combinacional cocientes de mAb 8B6 y topotecán eran probados (figura 2). El desplazamiento de la curva de dosis-respuesta de combinación hacia el lado sensible del gráfico indica que el régimen de combinación es más potente que cada monoterapia (Figura 4A). Para obtener los valores de CI y correspondiente ED50 , se calcularon valores de Fa. Los valores de ED50 de topotecán fueron significativamente más bajos en presencia de mAb 8B6 (p < 0.05, Figura 4B), indicando que mAb 8B6 sensibiliza las células tumorales a topotecan. Lo importante, los valores de CI fueron significativamente menos de 1.0 (p < 0,05), demostrando una interacción sinérgica (figura 5). Por lo tanto, mAb 8B6 tiene potencial como agente terapéutico adyuvante de quimioterapia de topotecán.

MAb anti-OAcGD2 8B6 mejora Antitumor actividad de topotecán En Vivo

Porque en vitro modelos ni tener en cuenta la vida media del fármaco ni el metabolismo de la droga, es necesario corroborar la en vitro resultados en vivo. Por otra parte, en vivo los modelos son muy útiles para evaluar la seguridad del régimen de combinación. Para confirmar que el sinergismo entre 8B6 topotecán y mAb fue específico para las células cancerosas, se evaluaron los efectos antineuroblastoma de la terapia de combinación en un modelo de xenoinjerto tumoral. Para ello, se seleccionó la cepa de ratón NSG inmunodeficiente severa. Estos ratones tienen una innata y un sistema inmune adaptante15y por lo tanto, hacen posible que investigadores excluir efectos inmunomoduladores inducidos por terapia de topotecan que puede afectar la potencia de mAb. El tratamiento fue comenzado una vez que los tumores muestran un volumen promedio de 50 ± 2,5 mm3 (figura 6A). Los tratamientos consistieron en cualquiera 8B6 mAb (150 μg i.v., día 7 y día 11), topotecan (0,36 mg/kg i.p., días 7-11), o una combinación de mAb 8B6 y topotecán. Los volúmenes del tumor fueron monitoreados durante el curso de la experimentación. Todas las terapias condujeron a retraso de crecimiento del tumor en comparación con grupos control (figura 6A). El régimen de combinación, sin embargo, inducida por el efecto más fuerte (figura 6A).

El crecimiento del tumor puede ser más analizado para estudiar la tasa de supervivencia sobre el tratamiento. Con este fin, el evento dando por resultado la eutanasia de ratón se definió como el volumen de tumor ≥ 1 cm3 por razones éticas. Esto nos permitió realizar un análisis de supervivencia de Kaplan-Meyer y para calcular el tiempo de la mediana de supervivencia libre de eventos para cada grupo experimental. Como se muestra en la Figura 6B, ambas monoterapias mejoraron la supervivencia libre de eventos (EFS) substancialmente en comparación con grupos control (la mediana EFS del grupo tratado con vehículo fue de 21 días del grupo control anticuerpo, 22 días; del grupo topotecan, 26 días ; del mAb 8B6 grupo, 29 días [Figura 6B]). Sin embargo, el tratamiento combinado tuvo el efecto más fuerte sobre la supervivencia de ratones, con una mediana de EFS a 39,5 días (p < 0.05, mAb 8B6 vs combinación; p < 0.01, topotecan vs combinación [Figura 6B]).

Debido a las interacciones sinérgicas pueden resultar en aumento de la toxicidad, la seguridad del régimen de combinación debe evaluarse. Como tal, la pérdida de peso comúnmente se utiliza como un marcador sensible para la vigilancia de la salud en roedores16. Así pues, peso pérdida-medido como una disminución en porcentaje del peso inicial-se mantuvo como un indicador de la tolerabilidad sistémica de cada régimen de prueba. No se observó ninguna pérdida de peso corporal, lo que sugiere que el tratamiento fue bien había tolerado (figura 7). Estos datos sugieren que la combinación de topotecan y mAb 8B6 representa un más potente eficacia antitumoral en vivo que cualquier agente solo, sin toxicidad detectable.

Figure 1
Figura 1 : Representación esquemática del estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Diseño del experimento de combinación en una placa de 96 pocillos con ratios de topotecán a mAb 8B6, preparado como seis soluciones. Las soluciones fueron preparadas como se describe en el protocolo. Etiquetados de 1 a 4 pozos sirven como mAb 8B6 soluciones, pozos etiquetados 5 a 8 servir como soluciones de topotecán y pozos etiquetados de 9 a 12 servir 8B6 mAb y topotecan (combinación) soluciones. Pozos de etiquetado A y H sirven como controles; pozos con la etiqueta B servir como 0.125 x ED50 concentración droga las soluciones; pozos con la etiqueta C servir de 0.25 x ED50 concentración droga las soluciones; pozos con la etiqueta D servir como 0,5 x ED50 concentración droga las soluciones; pozos de servicio E la etiqueta ED50 concentración droga las soluciones; pozos con la etiqueta F servir 2 x ED50 concentración droga las soluciones; pozos etiquetados G servir 4 x ED50 concentración droga las soluciones, como se indica. Agentes terapéuticos con dos unidades diferentes (por ejemplo, μg/mL para mAb 8B6 y nM de topotecán) se analizan en una combinación de la fijo-cociente (0.075, topotecán/8B6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Inyecciones. (A) inyección intravenosa en la vena de la cola de un ratón restringida, usando una jeringa de insulina de 27 x 1/2 en 1 mL. (B) inyección Intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho del abdomen del ratón, utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de 25 G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Relación de dosis-efecto de topotecan, mAb 8B6 y su combinación en la inhibición de la viabilidad del crecimiento de las células del neuroblastoma IMR5 después de 72 h de la exposición. Un ensayo MTT se realizó como se describe en el protocolo. Curvas de (A) la respuesta a la dosis que se muestra son representativos de tres repeticiones independientes, cada uno ejecuta en quadruplicates. Los datos se presentan como la media ± SD; p < 0.001. (B) ED50 de topotecán utilizado como agente único o en combinación con mAb 8B6. Los datos se presentan como la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada desde Faraj et al. 14. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 5
Figura 5 : Valores de índice de combinación. Porcentaje valores de supervivencia fueron transformados en valores afectados por la fracción de (Fa) y utilizados para calcular el índice de combinación (medida de la sinergia, aditividad y antagonismo) utilizando el software de la computadora, como se indica en el texto. En las parcelas de índice de combinación, los datos se presentan como media ± SD para tres réplicas independientes. Los resultados muestran que 8B6 mAb tuvo un efecto sinérgico con el topotecán (CI < 1). Esta figura ha sido modificada desde Faraj et al. 14. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Tratamiento combinado de xenoinjertos de IMR5 en ratones NSG con mAb 8B6 más topotecán. (A) ratones neuroblastoma humano IMR5 xenoinjertos fueron tratados con vehículo (PBS, i.p.), solo el topotecán (0,36 mg/kg, i.p.), control IgG solo (150 μg, i.v.), mAb 8B6 solo (i.v.) o topotecán y mAb 8B6 combinado, como se indica. La administración de tratamiento de anticuerpo 8B6 o control mAb comenzó el día 7 después de la inoculación de células IMR5 y se repitió una vez el día 11. El topotecán o tratamiento de PBS fue iniciado el día 7 y dado por cinco días consecutivos. Se controló el crecimiento del tumor, y se calcularon los volúmenes tumorales. El volumen de tumor media ± SEM de cada grupo de tratamiento (grupo de PBS, 9 ratones; todos los otros grupos, 10 ratones) son representados (* p < 0.05 para 8B6 mAb mAb 8B6 y topotecán junto, ** p < 0.01 topotecán contra mAb 8B6 y topotecán junto), como indicado. Se observó una reducción significativa en el volumen de xenoinjerto para el mAb 8B6/topotecán combinación, en comparación con los controles de drogas solamente, como se indica (p < 0.05). Libre de eventos (B) se muestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer de los diferentes grupos tratados. Esta figura ha sido modificada desde Faraj et al. 14. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Peso promedio para cada grupo de tratamiento, como se indica. El peso medio de los ratones en el día 0 se definió como peso de 100%. El peso de cada grupo se mantuvo estable durante el período de tratamiento. Los datos se presentan como la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada desde Faraj et al. 14. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Para predecir el efecto de la interacción con otros medicamentos, pueden utilizarse tres métodos: la metodología de isobologram17, la mezcla no lineal modelo18y la combinación índice1. Análisis de índice de combinación es el más comúnmente utilizado ya que su aplicación se simplifica por la disponibilidad de un programa informático fácil de usar. Para ello, primero hemos caracterizado la respuesta de dosis-efecto de cada agente utilizado solo o en combinación, mediante la realización de un ensayo MTT19. Esta metodología se basa en la capacidad de las células viables para reducir la sal de tetrazolio en un precipitado de color púrpura producto con un máximo de absorbancia de 570 nm19. Al morir, las células pierden la capacidad de convertir MTT formazán. Así, la cantidad del producto formazan coloreado es proporcional al número de células viables en cultura19. De hecho, hemos elegido esta metodología como una alternativa no radiactiva a la incorporación de timidina pertenecen al ADN para medir la célula proliferación19. Como tal, análisis de MTT se han adoptado ampliamente y siguen siendo populares en los laboratorios académicos como lo demuestran miles de artículos publicados. Mientras que se mide la cantidad de formazán por registrar la absorbancia a 570 nm con un espectrofotómetro de lectura de la placa, una longitud de onda de referencia de 620 nm a veces se utiliza pero no es necesario para la mayoría de las condiciones de ensayo. Teniendo en cuenta el paso crítico descrito aquí, encontramos que las condiciones de cultivo utilizadas para cultivar las células pueden afectar los resultados de los análisis MTT. Encontramos que el número de células viables, la actividad metabólica de la célula, la edad de las culturas y el número de pasos y detalles del medio de crecimiento pueden todos ser factores importantes. Por lo tanto, deben tenerse en cuenta al repetir el ensayo y análisis de datos. Además, las condiciones de cultivo celular difieren para cada líneas de celulares. Así, es complicado darle que ninguna clara indicaciones acerca de la densidad de siembra de la célula. Como regla general, un número medio de células entre 2.000-10.000 células por pozo es recomendado para lograr una densidad óptima de la célula dentro de 72 h. importante, reducción de MTT refleja el metabolismo de las células viables y no, concretamente, la célula proliferación o muerte celular. Por lo tanto, tampoco deben describir ensayos MTT como medición de proliferación de la célula ni la célula citotoxicidad20,11. La detección de muerte celular se basa en ensayos de células específicos. Por ejemplo, en estudios anteriores, se utilizan análisis de western blot para detectar la activación de la caspasa 3 o flujo cytometry análisis para detectar la fosfatidilserina en el membrana plasmática externa folleto, para evidenciar la actividad proapoptóticas de mAb 8B613.

Cuando pruebas de combinación de drogas, puede ser entregaron conjuntamente o sucesivamente en el tiempo. Dada la variedad del mecanismo de acción, es difícil proporcionar orientaciones precisas para la creación experimental relevante. Sin embargo, la mayoría de los investigadores utilizan directa pruebas de combinaciones de fármacos. Además, se utilizan concentraciones que producen un definido efecto agente único de 50% inhibición del crecimiento de la célula. Concentraciones de la droga que reflejan concentraciones plasmáticas alcanzables en pacientes son comúnmente consideradas relevantes clínicamente. Como tal, se realiza el análisis de dosis-efecto de la combinación de varias dosis, manteniendo la proporción de combinación constante con una dilución seriada del (ED50)mAb/cociente de ladroga (ED50), aunque no es un requisito absoluto 1. de la nota, los valores de CI deberían también calcularse en varios ED probado (por ejemplo, ED50, ED75y ED90) porque pueden cambiar con el Fa en una manera no lineal1. Después de realizar el análisis automatizado de los valores de CI, el coeficiente de correlación lineal r-valor estimado por los algoritmos debe ser > 0,9, para reflejar la bondad del ajuste de los datos experimentales. Valores de CI de < 1 indican valores de CI de la sinergia, = 1 indican la aditividad y los valores de CI de > 1 indican antagonismo1. Debido a la variabilidad en los métodos experimentales y el sistema biológico, el IC calculado debe someterse más a consideración estadística. Como tal, un método simple es repetir el experimento de la combinación de drogas varias veces seguido por el cálculo de los valores de CI resultantes antes de determinar las estadísticas de la media ± SD1. También se recomienda probar la combinación en el panel más grande posible de líneas de celulares, para tener en cuenta la variabilidad que existe entre ellos.

Importante, varios parámetros en el estudio en vitro no son tomados en consideración para la extrapolación en vivo . Por ejemplo, los de vitro viabilidad ensayos que ni tengan en cuenta que la vida media en vivo de la droga, ni el en vivo metabolismo de la droga que puede provocar la inactivación de la droga. Así, la extrapolación de in vitro en vivo sigue siendo una cuestión separada, y la droga beneficiosa interacción evidenciada in vitro debe ser aún más confirmado en vivo. Por lo tanto, una clara demostración de la sinergia en ratones xenoinjertos tumorales, utilizando el método de índice de combinación, ha sido publicado21. Sin embargo, en vivo los estudios requieren una gran cantidad de animales para definir con precisión la sinergia y son más caros y más desperdiciadores de tiempo. El modelo alternativo eficaz F-prueba todavía requiere importantes recursos22. Como un enfoque diferente para limitar el uso de un gran número de animales consiste en la demostración de la sinergia de drogas en los modelos de cultura celular seguido por la evidencia de una mayor respuesta antitumoral de la combinación en un estudio de xenoinjerto limitada14, hemos usado las células de neuroblastoma humano IMR5 como el objetivo del tumor para el estudio en vivo . Nos retuvo IMR5 células porque son tumorígeno en ratones inmunocomprometidos23. Mientras que los modelos de xenoinjertos de tumores humanos proporcionan modelos valiosos para probar drogas combinaciones en vivo24, puede ser difícil de establecer tales modelos de una variedad de célula líneas25. Para aumentar la incidencia de la formación de tumores en ratones, las células se pueden inyectar en ratones con una membrana basal de la matriz como un vehículo25. Importante, ya que la matriz de la membrana basal se polimeriza y solidifica a temperaturas superiores a 5 ° C, todos los cultureware o los medios de comunicación entre en contacto con la matriz de la membrana basal deben ser prechilled/ice-cold, y las soluciones de membrana basal se deben tener hielo durante el proceso entero25. Con el uso de la matriz de la membrana basal, se observó una tasa de tome 100% con las células IMR5, mientras que, en ausencia de la matriz de la membrana basal, esta línea celular demostró un < 80% tome velocidad (datos no mostrados). Además, para aumentar la incidencia de injerto de tumor, matriz de la membrana basal también puede aumentar el crecimiento de tumor tasa25. Observamos que los xenoinjertos habían aparecido durante el día 11. Sin embargo, durante los primeros siete días después el desafío de la célula del tumor, la presencia de grumos pudo observarse, que puede ser causada por la presencia del inóculo inicial (datos no mostrados). Por lo tanto, no consideramos las medidas de tamaño de tumor significativo antes de este tiempo. Utilizando la matriz de la membrana basal permitió reducir el número de ratones en el ambiente experimental y para realizar el experimento en vivo dentro de tres meses.

Dosificaciones de drogas anticuerpos pueden variar dependiendo de la cepa de ratón y la línea de celular. Debido a la limitación de la prueba de viabilidad en vitro para extrapolar las dosis de drogas anticuerpos en vivo descrita, dosis clínicamente relevantes se conservaron para 8B6 topotecán y mAb en el en vivo experimental ajuste, según los datos publicados por la otros26,27. Extrapolar el ajuste de la dosificación humana a ratones, siguieron las directrices previamente publicados28 . Sí, inyectó 150 μg de anticuerpo 8B6 i.v. al día 7, seguido por una segunda inyección cinco días más tarde (total dosis/ratón = 300 μg). Tratamiento de topotecán comenzó el mismo día como la primera inyección de mAb 8B6 inyectando topotecán de 0,36 mg/kg o PBS control i.p. por cinco días consecutivos. Teniendo en cuenta el paso crítico descrito aquí, recomendamos a partir de infusiones de anticuerpos cuando los xenoinjertos tumorales alcanzan ~ 50 m m3. Mayores volúmenes de xenoinjerto tumoral resultará en una menor tasa de respuesta debido a las cargas del tumor claramente correlacionan inversamente con la concentración de anticuerpos, la exposición de anticuerpos y anticuerpo eficacia29. Nos retuvo también la pérdida de peso como indicador de la tolerabilidad sistémica de cada régimen probado16. Sin embargo, la interpretación de pesos recogidas no puede ser útil con un tumor grande masa. En este caso, cuerpo condición puntuación, como se describe en otra parte16, se recomienda.

Los tumores se pueden recoger en diferentes puntos temporales para el análisis de inmunoquímica, para proporcionar más información sobre el mecanismo de acción activa in vivo. En un trabajo previo, el índice de apoptosis tumoral se evaluó después de mAb 8B6 infusión13. Para ello, las células apoptotic del tumor fueron detectadas usando un ensayo TUNEL del13. Además, el porcentaje de núcleos de célula del tumor fue anotado con Ki67 antígeno positiva tinción para analizar el tumor proliferación índice13.

Inmunidad innata y adaptativa, con la pérdida de células T, linfocitos B y natural killer (NK) las células con macrófagos reducción y funciones de las células presentadoras de antígeno y la ausencia de circulación complemento30carecen de ratones inmunodeficientes severos. Así, este Protocolo no permiten extraer conclusiones sobre posibles efectos de la quimioterapia en potenciar la terapia mAb modificando el microambiente tumoral en vivo31. Sin embargo, ambos efectos inmunomoduladores supuesta del agente quimioterápico y el papel del fragmento cristalizable (Fc) región del mAb en el aumento de la potencia de drogas antitumorales merecen consideración, pero estas preguntas requieren la disponibilidad de un syngeneic modelo con un sistema inmune intacto y un microambiente tumoral fisiológica.

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Disclosures

S.Fa., J.F. y S.B. se señalan como inventores de pendientes patentes que cubren la aplicación clínica de anticuerpos terapéuticos anti-O-acetil-GD2.

Acknowledgments

Concesión de la ayuda: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le cáncer comité de Loire-Atlantique, comité de Morbihan y comité de Vendée, une rose pour S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin y la Société Française de Lutte contre les Los cánceres et les leucémies de l ' enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. y J.F. son apoyados por La Ligue Contre Le cáncer. Los autores agradecen a la UTE-instalación de la estructura Fédérative de Recherche François Bonamy. Los autores también agradecen el Dr. S. Suzin (Inserm, París) para proporcionar las células IMR5 y Sra. H. Estéphan su asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

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