Synthèse et détermination de Structure des isomères PIIIA µ-conotoxine avec disulfure différentes connectivités
Summary
Peptides riches en cystéine incorporer des structures en trois dimensions distinctes selon leur connectivité disulfure. Synthèse ciblée des isomères individuels disulfure est nécessaire lors de l’oxydation de la mémoire tampon ne conduit pas à la connectivité de disulfure désiré. Le protocole porte sur la synthèse sélective des peptides 3-disulfure-collé et leur analyse structurale à l’aide d’études RMN et SM/SM.
Abstract
Peptides avec un nombre élevé de cystéines sont habituellement influencés au sujet de la structure tridimensionnelle par leur connectivité disulfure. Il est donc très important d’éviter la formation de la liaison disulfure indésirables au cours de la synthèse peptidique, car elle peut entraîner dans une structure complètement différente de peptide et par conséquent modifié bioactivité. Toutefois, la formation correcte de multiples liaisons disulfide dans un peptide est difficile à obtenir en utilisant des méthodes pliantes automatique standards tels que les protocoles de tampons classiques d’oxydation, parce que plusieurs des connectivités disulfure peuvent se former. Ce protocole représente une stratégie avancée nécessaire pour la synthèse ciblée de plusieurs peptides avec un pont disulfure qui ne peuvent pas être synthétisés par l’oxydation de la mémoire tampon en qualité et en quantité. L’étude montre l’application d’une stratégie de groupe protecteur distincts pour la synthèse de tous les isomères possibles peptide 3-liaisons disulfure de µ-conotoxine PIIIA de manière ciblée. Les peptides sont préparées par synthèse de peptide de phase solide Fmoc-basé en utilisant une stratégie de groupe protecteur pour la formation de la liaison disulfure définis. Les paires respectives des cystéines sont protégés avec trityl (Trt), acétamidométhyle (Acm) et tert-butyle (t-Bu) protégeant les groupes pour s’assurer qu’au cours de chaque étape de l’oxydation seulement les cystéines requis sont déprotégés et liés. Outre la synthèse ciblée, une combinaison de plusieurs méthodes d’analyse sert à clarifier le pliage correct et la génération des structures peptidiques désirée. La comparaison entre les différents isomères de liaison disulfure-3 indique l’importance de déterminer avec précision et la connaissance de la connectivité de disulfure pour le calcul de la structure tridimensionnelle et interprétation de la Commission activité des isomères peptide. La caractérisation analytique comprend l’élucidation de liaison disulfure exacte via l’analyse de spectrométrie de masse (MS/MS) en tandem qui s’effectue avec des dérivés alkylés et partiellement réduits de l’isomère de peptide intact produites par un protocole adapté. En outre, les structures de peptide sont déterminées à l’aide d’expériences 2D par résonance magnétique nucléaire (RMN) et les connaissances obtenues par l’analyse MS/MS.
Introduction
L’utilisation de peptides bioactifs dans la recherche pharmaceutique et développement est hautement reconnue, parce qu’ils représentent les composés puissants et hautement sélectifs pour des cibles biologiques spécifiques1. Pour leur bioactivité, cependant, la structure tridimensionnelle est d’une grande importance pour réaliser la structure-activité relation études2,3,4. En dehors de la séquence primaire des acides aminés qui influe sur la conformation générale, liaisons disulfide stabilisent sensiblement la structure de peptides riches en cystéine5. Plusieurs peptides avec un pont disulfure incluent conotoxines comme µ-PIIIA de Conus purpurascens qui contient six cystéines dans sa séquence. Cette teneur élevée de cystéine permet théoriquement la formation des 15 disulfure isomères. La connectivité de disulfure correct est très importante pour l’activité biologique6,7. Toutefois, la question qui se pose est si il n’y a plus d’une conformation bioactive peptides naturels et si oui, lequel de ces isomères possède la plus forte activité biologique ? Dans le cas de µ-conotoxines, les cibles biologiques sont des canaux ioniques de sodium voltage-dépendants, et µ-PIIIA en particulier est plus puissant pour les sous-types NaV1.2, NaV1.4 et NaV1.73.
La synthèse des peptides avec un pont disulfure est possible en utilisant différentes méthodes. La méthode la plus pratique pour la formation de ponts disulfures dans un peptide est l’approche dite de pliage automatique oxydatif. Ici, le linéaire précurseur du peptide cyclique désiré est synthétisé tout d’abord à l’aide de synthèse de peptide de phase solide, qui est après que le clivage de l’appui de polymère soumis à l’oxydation dans un système de tampon. Agents actifs en oxydoréduction comme le glutathion réduite et oxydée (GSH/GSSG) sont souvent ajoutés pour promouvoir la formation des liaisons disulfide. Le principal inconvénient du tampon-soutenu pliage automatique, c’est que les ponts disulfures ne forment pas sélectivement de façon progressive. Par rapport au peptide natif, pour lesquels, isomère disulfure spécifiques qu’un seul est souvent décrite, il est possible d’obtenir de nombreux autres isomères avec cette approche8. µ-PIIIA a déjà été montré se traduire par au moins trois isomères différemment pliés à pliage automatique dans une précédente étude3. La séparation d’un tel mélange d’isomère est assez difficile en raison des temps de rétention similaires si l’utilisation de méthodes de purification chromatographique9. La synthèse ciblée d’un isomère est donc avantageuse. Plus précisément les produits qu’un isomère avec connectivité disulfure définie, une stratégie spéciale est requise à laquelle adhère le disulfure sont successivement fermées. Par conséquent, le précurseur linéaire transportant des groupes protecteurs distinctes aux paires individuelles de cystéine est synthétisé sur le soutien de polymère. Après l’élimination, les paires de cystéine sont individuellement et successivement déprotégé et liée à une réaction d’oxydation pour donner le disulfure désiré obligations10,11,12,13, 14 , 15 , 16. après la synthèse et la purification du produit de la réaction, il est nécessaire de confirmer l’identité et la connectivité du disulfure de méthodes analytiques appropriées. Il existe plusieurs méthodes d’analyse pour l’élucidation de la séquence primaire des acides aminés, par exemple., MS/MS, alors que la détermination de la connectivité de disulfure reste encore bien moins étudiée. En dehors de la complexité de ces multiples liaisons disulfure de peptides, impuretés issues du produit (p. ex.., du disulfure de brouillage), en raison de l’échantillon préparation et marche à suivre peuvent compliquer l’analyse. Dans cet article, nous montrons que l’utilisation d’une combinaison de différentes techniques d’analyse est nécessaire de préciser clairement l’identité des liaisons disulfide dans les isomères de µ-PIIIA. Nous avons combiné des méthodes chromatographiques avec la spectrométrie de masse et fourni les mêmes échantillons de spectroscopie RMN. En laser assistée par matrice desorption/ionization(MALDI) analyse MS/MS, nous avons identifié les ponts disulfures en utilisant la réduction partielle et dérivatisation iodoacétamide car analyse descendante n’est pas possible pour ce peptide. Des expériences RMN 2D ont été réalisées afin d’obtenir une structure tridimensionnelle de chaque isomère. Ainsi, en combinant différentes méthodes analytiques sophistiqués, il est possible d’élucider correctement le disulfure connectivité et la structure tridimensionnelle du complexe de plusieurs peptides disulfure-collé7.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici pour la synthèse des peptides riches en cystéine tels que µ-PIIIA représente une possibilité pour produire sélectivement les isomères de liaison disulfure de la même séquence d’acides aminés. Par conséquent, mis en place des méthodes telles que solide axée sur le Fmoc phase de synthèse de peptide18 et une stratégie de groupe protecteur définie pour la formation régiosélective des ponts disulfures ont utilisé16. La synthèse de p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier A. Resemann, F. J. Mayer et D. de Suckau de Bruker Daltonics GmbH Brême ; D. Tietze, A. A. Tietze, Schmidts V. et C. Thiele de l’Université de technologie de Darmstadt ; O. Ohlenschläger de l’Iéna FLI, M. Engeser de l’Université de Bonn ; K. Kramer, A. Harzen et H. Nakagami, de l’Institut Max Planck pour Plant Breeding Research, Cologne ; Susanne Neupert de l’Institut de zoologie, Cologne ; et les installations biomoléculaire de spectroscopie par résonance magnétique de l’Université de Francfort pour technique prend en charge, modules, de formation et d’accès aux instruments. Soutien financier de l’Université de Bonn à D.I. tient à reconnaître.
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
- Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie – International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
- Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
- Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
- Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
- Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. 생화학. 50 (17), 3414-3431 (2011).
- Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
- Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
- Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
- Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
- Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
- Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
- Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
- Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
- Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
- Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
- Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie – International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).
