合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定
Summary
システイン豊富なペプチッドは、二硫化接続に応じて異なる立体構造に折る。個々 のジスルフィド異性体のターゲットを絞った合成は、バッファー酸化が必要な二硫化接続につながるしない場合に必要です。プロトコルを扱う 3 ジスルフィド結合ペプチド、NMR および MS/MS 研究を用いた構造解析の選択的合成。
Abstract
通常にシステインの数が多いを持つペプチド立体構造に関する、二硫化接続によって受けます。こうしてペプチド合成時に不要なジスルフィド結合の形成を避けるために非常に重要な完全に異なるペプチド構造で起因するかもしれないので、結果として生理活性を変更します。ただし、ペプチドの複数のジスルフィド結合の正しい形成がいくつか二硫化接続を作成できるため、従来バッファー酸化プロトコルなど標準的な自己折りたたみメソッドを使用して取得することは困難。このプロトコルは、ターゲットを絞った高品質と量のバッファー酸化を介して合成できない複数のジスルフィド架橋ペプチド合成に必要な高度な戦略を表します。研究では、ターゲットを絞った形で μ-コノトキシン PIIIA のすべての可能な 3 ジスルフィド結合ペプチド異性体の合成のための明確な保護グループ戦略のアプリケーションを示します。ペプチドは、保護グループ戦略定義ジスルフィド結合形成に使用して fmoc 保護基固相ペプチド合成によって準備されます。システインのそれぞれのペアは、トリチル (Trt)、acetamidomethyl (Acm)、 tertと保護されている- とは、すべての酸化ステップ中にそののみ必要なシステインは deprotected リンクを確認するグループのブチル (tBu) を保護します。対象となる合成に加えて分析手法の組み合わせを使用して、正しい折りたたみ目的ペプチド構造の生成を明らかにします。異なる 3 ジスルフィド結合異性体の比較を示し、正確な決定の重要性二硫化接続立体構造の計算および生物学的の解釈のための知識ペプチド異性体の活動。分析の特性には、適応プロトコルによって生成されたそのままのペプチド異性体の部分的に減少およびアルキル化誘導体で行われるタンデム質量分析 (MS/MS) 解析による正確なジスルフィド結合解明が含まれています。さらに、ペプチドの構造は、2次元核磁気共鳴 (NMR) 実験および MS/MS 分析から得られた知識を使用して決定されます。
Introduction
特定の生物学的ターゲット1の強力かつ選択性の高い化合物を表すため生理活性ペプチド医薬品の研究開発での使用は認めです。その生物活性の立体構造は、非常に重要な構造活動関係研究2,3、4を実行するために。別に全体の構造に影響を与える主なアミノ酸シーケンス、二硫化物結束は大幅システイン豊富なペプチッド5の構造を安定させます。複数のジスルフィド架橋ペプチドには、そのシーケンス内の六つのシステインを含む円錐ササから μ PIIIA など conotoxins が含まれます。この高システイン コンテンツ 15 ジスルフィド異性体の形成が可能で理論的に。正しい二硫化接続は非常に重要な生物学的活性6,7 です。しかし、問題が発生は、天然のペプチドとかどうかは、それらの異性体の所有している最高の生物学的活性の 1 つ以上の生理活性構造があるかどうかですか。Μ-conotoxins の場合生物学的ターゲットの電位依存性ナトリウム イオン チャネル、μ PIIIA は特にサブタイプ NaV1.2、Na の最も強力なV1.4 と NaV1.73。
ジスルフィド架橋ペプチドの合成は、さまざまな方法を使用して実現できます。ペプチド内ジスルフィド結合の形成のための最も便利な方法は、いわゆる酸化自己折り畳み方法です。ここでは、まず高分子のサポートから胸の谷間がバッファー システムに酸化を受けた後である固相ペプチド合成を使用して目的の環状ペプチドの線形の前駆体を合成します。還元と酸化型グルタチオン (GSH/GSSG) などのレドックス活性剤がしばしばジスルフィド結合の形成を促進するために追加されます。折り畳み式のバッファーでサポートされている自己の主な欠点は、二硫化物結束は段階的で選択的に形式がないことです。多くの場合 1 つだけ特定のジスルフィド異性体は記載されて、ネイティブのペプチドと比較してこのアプローチ8とその他の多数の異性体を得ることが可能です。Μ PIIIA は既に自己以前の研究3で折り畳み時に異なる 2 つ折り異性体、少なくとも 3 つの結果に示されています。このような異性体混合物の分離は、クロマトグラフィー精製方法9を使用して同じような保持時間のため難しい。特定の異性体のターゲットを絞った合成のため有利です。ジスルフィド結合をで定義された二硫化接続、特別な戦略を持つ異性体が必要な具体的にプロデュースして連続して閉じられます。したがって、個々 のシステインの組み合わせで異なる保護グループを運ぶ線形前駆体高分子担体を合成します。、除去後システイン ペア個別し順次 deprotected、リンク目的二硫化物結束10,11,12,13,を生成する酸化反応で14,15,16. 合成と反応生成物の精製後、適当な分析方法により id とジスルフィド結合接続を確認する必要です。例えば一次アミノ酸シーケンスの解明のため多数の分析方法があります。、MS/MS、二硫化接続の定量は依然としてはるかに少ない調査中。このような複数のジスルフィド結合のペプチドを製品関連不純物の複雑さから離れて (e.g。、二硫化スクランブルから)、サンプルのため準備や作業を解析さらに複雑にすることができます。本稿ではっきりと μ PIIIA 異性体のジスルフィド結合のアイデンティティを明らかにする必要があるさまざまな分析手法の組み合わせの使用を示します。質量分析法とクロマトグラフィー法を組み合わせるし、NMR 分光法に同じサンプルを提供しました。マトリックス支援レーザー desorption/ionization(MALDI) ・ MS/MS 分析の部分還元とヨードアセトアミド誘導トップダウン解析はこのペプチドを用いたジスルフィド結合がわかりました。各異性体の立体構造を得るために 2D NMR 実験を行った。したがって、異なる洗練された分析方法を組み合わせることによって複数のジスルフィド結合ペプチド7ジスルフィド接続および複合体の三次元構造を正しく解明することが可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
Μ PIIIA は、同じアミノ酸配列からジスルフィド結合異性体を選択的に生成する可能性を表すなど、システインに富むペプチドの合成のためここに記載されているメソッド。したがって、fmoc 保護ベース固体等相ペプチド合成18とジスルフィド結合の選択的形成のための定義された保護グループ戦略が使用される16を設立しました。固相ペプチド合成は、自動?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A. Resemann、f. j. マイヤー、ブルカー ・ ダルトニクス社ブレーメン; から + Suckau に感謝したいと思いますD. 人、A. A. 人、v. シュミッツ ・、ダルムシュタット工科大学; C. シールFLI イエナ、ボン大学から m. Engeser から o. OhlenschlägerK. Kramer、A. Harzen およびマックス ・ プランク植物育種研究、ケルン; から H. 中頭ケルン; 動物学研究所からスザンヌ Neupertブランクフルトの大学の生体磁気共鳴分光設備技術のサポート、トレーニング、および楽器へのアクセスします。直噴にボン大学による財政援助は感謝します。
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
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