Синтез и определение структуры изомеров PIIIA µ-Conotoxin с различными дисульфида связность
Summary
Цистеин богатые пептиды сложить в собственный трехмерной структуры в зависимости от их соединения дисульфида. При буфера окисления не приведет к желаемой дисульфида подключения требуется целевой синтез отдельных дисульфида изомеров. Протокол касается селективный синтез пептидов, 3-дисульфид стружечные и их структурного анализа с помощью исследования ЯМР и МС/МС.
Abstract
Пептиды с высокое количество которым находятся обычно под влиянием относительно трехмерной структуры их соединения дисульфида. Он таким образом очень важно, чтобы избежать нежелательных дисульфидными облигаций формирования во время синтеза пептида, потому что это может привести к совершенно разных пептидных структуры и соответственно изменены биологическую. Однако правильное формирование нескольких дисульфидными облигаций в пептид трудно получить с помощью стандартных методов самостоятельной складной как обычного буфера окисления протоколы, потому что могут быть сформированы несколько дисульфида связность. Этот протокол представляет передовые стратегии, необходимые для целенаправленного синтеза нескольких мост дисульфидных пептиды, которые не могут быть синтезированы через буфер окисления в высокое качество и количество. Исследование демонстрирует применение различных защиты группы стратегии для синтеза всех изомеров возможно 3-дисульфид стружечные пептид µ-conotoxin PIIIA в целевой путь. Пептиды подготовленный на основе Fmoc твердой фазы пептидного синтеза с использованием стратегию защиты группы для формирования определенных дисульфидными облигаций. Соответствующих пар которым защищены с trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) и трет-бутила (tбу) защита группы чтобы убедиться, что во время каждого шага окисления только необходимые которым deprotected и связаны. Помимо целенаправленного синтеза сочетание нескольких аналитических методов используется для уточнить правильный складные и поколения желаемого пептид структур. Сравнение различных изомеров 3-дисульфид стружечные указывает на важность точного определения и знание дисульфида подключения для расчета трехмерной структуры и интерпретации биологических деятельность пептида изомеров. Аналитическая характеристика включает точное дисульфида Бонд разяснения через тандем масс-спектрометрия (МС/МС) анализ, который проводится с частично сокращенной и алкилированные производные нетронутыми пептид изомера, подготовлен адаптированный протокол. Кроме того пептид структуры определяются с помощью 2D ядерного магнитного резонанса (ЯМР) эксперименты и знания, полученные от анализа МС/МС.
Introduction
Использование биоактивные пептиды в фармацевтических исследований и разработок является признанным, потому что они представляют собой мощный и высокоселективных соединений для конкретных биологических цели1. Для их биологическую однако, трехмерная структура имеет большое значение для того, чтобы выполнять структура активность отношения исследования2,3,4. Помимо первичного аминокислотной последовательности, которая влияет на общую конформации дисульфидными облигаций значительно стабилизации структуры хвоща богатые пептиды5. Несколько мост дисульфидных пептиды включают конотоксины например µ-PIIIA от конус скворец , который содержит шесть которым в своей последовательности. Это высокий хвоща содержимое теоретически позволяет формирование 15 дисульфида изомеров. Правильные дисульфида подключения является очень важным для биологической активности6,7. Однако возникает вопрос есть ли более чем одной биоактивные конформации естественных пептидов и если да, какие из этих изомеров обладает высокой биологической активностью? В случае µ конотоксины, биологической цели являются воротами напряжения натрия ионных каналов, и µ-PIIIA, в частности, является самым мощным для подтиповV1.2, Na Na NaV1.7 иV1.43.
Синтез пептидов, дисульфид мост может быть достигнуто с помощью различных методов. Наиболее удобный способ для образования дисульфидных связей внутри пептид является так называемого оксидативного самостоятельно складной подход. Здесь линейная прекурсора желаемый циклические пептиды синтезируется, сначала с помощью твердофазный пептидного синтеза, который после расщепления от полимерных поддержки подвергается окислению в буферную систему. Редокс активных агентов, таких как восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG) часто добавляются для поощрения образования дисульфидных связей. Основным недостатком буфер поддерживается собственной складывания является, что дисульфидными облигаций формируются в ступенчатой моды не выборочно. По сравнению с родной пептид, для которого часто описывается только один конкретный дисульфида изомер, это можно получить многочисленные другие изомеры с этот подход8. Уже было показано, что мкг-PIIIA привести к по крайней мере три по-разному сложенном изомеров после индивидуальной складывающиеся в предыдущем исследовании3. Разделение такой смеси изомером является довольно трудно из-за аналогичные удержания раз, если с помощью хроматографических очистки методы9. Поэтому выгодно целевых синтез определенных изомеров. Производить специально требуемого изомер с определенными дисульфида связи, специальной стратегии в котором дисульфидными облигаций последовательно закрываются. Таким образом линейной прекурсоров, перевозящих отдельные группы защиты в отдельных хвоща пар синтезируется на поддержку полимера. После ликвидации хвоща пары являются индивидуально и последовательно deprotected и связаны в реакции окисления приносить желаемых дисульфидными облигаций10,11,12,13, 14 , 15 , 16. после синтеза и очистки продукта реакции, он требуется для подтверждения личности и соединения дисульфида подходящих методов анализа. Многочисленные аналитические методы доступны для выяснения основной аминокислотной последовательности, например., МС/МС, в то время как определение дисульфида подключения по-прежнему остается гораздо менее исследованы. Помимо сложности таких несколько дисульфида стружечные пептиды, связанные с продуктом примеси (например., от дисульфида скремблирования), из-за образец подготовки и работы могут еще более усложнить анализ. В этом документе мы покажем, что использование сочетания различных аналитических методов необходимо недвусмысленно разъяснить удостоверение дисульфидных связей в изомеров µ-PIIIA. Мы есть комбинированные методы хроматографии с масс-спектрометрии и же образцы для ЯМР спектроскопии. В desorption/ionization(MALDI) при содействии матрицы лазерный анализ МС/МС мы определили дисульфидными облигаций с помощью частичного сокращения и iodoacetamide деривации, потому что сверху вниз анализ не является возможным для этого пептида. Для того чтобы получить трехмерную структуру каждого изомера были эксперименты 2D ЯМР. Таким образом путем объединения различных сложных аналитических методов, это возможно для выяснения должным образом дисульфида подключения и трехмерной структуры комплекса несколько дисульфида стружечные пептиды7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь для синтеза пептидов хвоща богатые, такие как µ-PIIIA представляет возможность производить избирательно дисульфида стружечные изомеров от такую же последовательность аминокислот. Таким образом созданы такие методы, как на основе Fmoc твердых этапа пептидного синте?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить A. Resemann, Майер J. F. и д Suckau от компании Bruker Daltonics GmbH Бремен; D. Титце, а. а. Титце, V. варьете и C. Thiele из технологического университета Дармштадта; O. Ohlenschläger из FLI Jena, м. Engeser из университета Бонна; K. Крамер, A. Harzen и H. Накагами из Института Макса Планка для исследования селекции растений, Кёльн; Susanne Neupert из Института зоологии, Кёльн; биомолекулярных магнитно-резонансная спектроскопия объектов Франкфуртского университета для технической поддержки, учебные модули, и доступ к документам. Финансовой поддержке Боннского университета к д.и. с благодарностью.
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
- Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie – International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
- Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
- Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
- Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
- Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. 생화학. 50 (17), 3414-3431 (2011).
- Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
- Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
- Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
- Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
- Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
- Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
- Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
- Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
- Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
- Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
- Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie – International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).
